2017年主管檢驗技師考試臨床免疫學(xué)和免疫檢驗講義第十二章固相膜免疫測定

1、第十二章固相膜免疫測定第節(jié)概述固相膜免疫測定以 微孔膜作為固相。固相膜的特點(diǎn)在于其 多孔性、非共價鍵 高度吸附抗體或抗原 和易 于漂洗等，固相膜像濾紙一樣，可被 液體穿過流出，液體也可以通過毛細(xì)管作用 在膜上向前移行。標(biāo)記物 可用酶或各種有色微粒子，如彩色膠乳、膠體金或膠體硒等。一、常用的固相膜固相膜免疫測定中常用的膜為硝酸纖維素（NQ膜以及玻璃纖維素（fiberglass ）膜、尼龍（nylon）膜、聚偏氟乙烯（PVDF膜等。二、固相膜的技術(shù)要求1. 孔徑：用于 穿流法的膜一般選擇0.4卩m左右，用于 橫流法的膜可選擇510卩2. 流速：以ml/ （ cm2 min）表示。孔徑大，流速快。3

2、. 蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強(qiáng)，以卩g/cm2表示。4. 均一性：優(yōu)質(zhì)的膜應(yīng)具有良好的均一性，這樣才能保證試劑批內(nèi)的均一性。第二節(jié)免疫金標(biāo)記技術(shù)利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)志 物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量 的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（IGSS）。一、膠體金的制備（一）制備原理：一般采用還原法，常用的還原劑有枸櫞酸鈉、鞣酸、維生素 C、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑，使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠。（二）技

3、術(shù)要點(diǎn)：金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或免疫凝集試驗的基礎(chǔ)。（三）注意事項1. 玻璃容器的清潔：玻璃表面污染會干擾膠體金顆粒的生成，用前經(jīng)過強(qiáng)酸洗，后硅化。2. 試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其1%水溶液在4C可穩(wěn)定數(shù)月不變，實驗用水一般用雙蒸餾水，實驗室中的塵粒要盡量減少，否則 實驗的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。二、免疫金制備（一）制備原理：免疫金是指膠體金與抗原或抗體等大分子物質(zhì)的結(jié)合物，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中， 習(xí)慣上稱之為金探針

4、。蛋白質(zhì)被吸附到膠體金顆粒表面而結(jié)合的過程。（二）技術(shù)要點(diǎn)1. 膠體金溶液的pH:原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿。2. 蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量（三）注意事項多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑，PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長期保存；為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異 性吸附反應(yīng)。第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理一、斑點(diǎn)免疫滲濾試驗（IFA）用于檢測各種傳染病的抗體和腫瘤標(biāo)記物等，以及用于檢測尿液HCG的“金標(biāo)”早孕診斷試劑。（一）原理：將抗原或抗體點(diǎn)加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，將膜貼于吸水材料上，依次在膜上滴

5、 加標(biāo)本、免疫膠體金及洗滌液等試劑進(jìn)行抗體或抗原反應(yīng)，過量試劑很快滲入吸水材料中。抗原抗體反應(yīng)后，形成大分子膠體金復(fù)合物，從而使陽性結(jié)果在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。液體通過微孔濾膜時，滲濾液中的抗原或抗體與膜上的抗體或抗原相接觸，起到親和層析的濃縮，達(dá)到快速檢測的目的， 同時洗滌液的滲入在短時間內(nèi)即可達(dá)到徹底洗滌的目的，簡化了操作步驟。（二）方法類型1. 雙抗體夾心法測抗原：用抗體結(jié)合在微孔濾膜中央，滴加待檢標(biāo)本，抗原抗體反應(yīng)后，滴加金標(biāo)抗 體，加洗滌液洗滌后，陽性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)。2. 間接法測特異性抗體：用抗原包被在微孔濾膜上，滴加待測標(biāo)本，滴加洗滌液洗滌后，滴加金標(biāo)抗抗體，加洗滌液洗滌后，

6、陽性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)。該法由于血清標(biāo)本中非目的igG的干擾，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。（三）實驗材料1. 滴金反應(yīng)板，為膠體金免疫滲濾試驗中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點(diǎn)加了抗原 或抗體的醋酸纖維素膜片三部分組成；2. 膠體金標(biāo)志物；3. 洗滌液；4. 抗原參照品或抗體陽性對照品。（四）技術(shù)要點(diǎn) 本方法實驗操作非常簡單，其操作要點(diǎn)為：1將反應(yīng)板平放于實驗臺面上，于小孔內(nèi)滴加含待測抗原的標(biāo)本12滴，待完全滲入，與膜上的抗體反應(yīng)而結(jié)合在膜上。2. 于小孔內(nèi)滴加膠體金標(biāo)記抗體試劑12滴，待完全滲入，使膠體金標(biāo)記抗體與結(jié)合在膜上的抗原反應(yīng)。3. 于小孔內(nèi)滴加洗滌液 23滴，待完全滲入，洗去

7、未結(jié)合的膠體金標(biāo)記抗體。4. 結(jié)果觀察 在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點(diǎn)者判為陽性反應(yīng)，反之則為陰性反應(yīng)。斑點(diǎn)呈色的深 淺相應(yīng)地提示陽性強(qiáng)度。二、斑點(diǎn)免疫層析試驗（一）原理：免疫層析試驗的原理與免疫滲濾相同，不同點(diǎn)在于液體的移動不是通過直向的穿流，而是基于層析作用的橫流。在一塑料片條上依次粘貼如下組分：吸水紙；玻璃纖維膜，膜上固定著干燥的金標(biāo)抗體；硝酸纖維素膜，膜上包被著線條狀的抗體；吸水紙。（二）方法類型：多用于檢測抗原，但亦可用于檢測抗體。常見方法類型有：1. 雙抗體夾心法測抗原2. 競爭法測小分子抗原3. 間接法測抗體：為了消除待測血清標(biāo)本中大量的非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)

8、記抗人IgG,降低了試驗敏感性，膠體金間接免疫層析法測抗體常設(shè)計成反流免疫層析法。（三）技術(shù)要點(diǎn)1. 在520分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。2. 結(jié)果判斷：陰性為出現(xiàn) 1條棕紅線質(zhì)控條帶；陽性為出現(xiàn)2條棕紅線條帶；無棕紅線條帶出現(xiàn)為試劑失效。（四）臨床應(yīng)用該技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，只能作為定性或半定量試驗。目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在的物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物等）和正常含量極低 而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如HCG等）的檢測。三、斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗加少量抗原于硝酸纖維素（NO膜上，干燥后進(jìn)行封閉；然后滴加 樣品血清；洗滌后再滴加酶標(biāo)二抗， 最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP標(biāo)志物，常用

9、二氨基聯(lián)苯胺）；陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度較普通 ELISA高，試劑用量少，操作簡單，NC膜可長期保存不影響活性。四、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗（ELISPOT）（一）原理：T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或 B細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體被PVDF膜上特異性單克隆抗體捕獲。再與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF膜出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)為陽性反應(yīng) 。（二）ELISPOT與 ELISA 的區(qū)別1. ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。2. ELISPOT通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置

10、上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下或通過儀器對斑點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)，1個斑點(diǎn)代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。3. 由于是單細(xì)胞水平檢測，ELISPOT比ELISA和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬30萬個細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。4. 捕獲抗體為高親和力、高特異性和低內(nèi)毒素McAb在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，如移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測、疫苗發(fā)展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、腫瘤研究、過敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的篩 選等五、免疫印跡法（IBT）又稱Western-b

11、lot ，將SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合。第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE。抗原等蛋白樣品經(jīng) SDS處理后帶負(fù)電荷，在聚丙 烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染 色后才顯出電泳區(qū)帶）。第二階段為電轉(zhuǎn)移。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體（常為多克隆抗體）和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3, 3-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨。并可根據(jù)S

12、DS-PAGE時加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。免疫印跡中需要注意的問題1.抗體的性質(zhì) 影響免疫印跡成敗的一個主要因素是抗原分子中可被抗體識別的表位的性質(zhì)。只有那 些能識別耐變性表位的抗體可與抗原結(jié)合，多數(shù)多克隆抗血清中或多或少地含有這種類型的抗體，所以在 免疫印跡實驗中常選用多克隆抗體。2.IBT的靈敏度有若干種方法常用于提高免疫印跡的靈敏度，一種是在電泳之前應(yīng)用免疫沉淀法將抗原進(jìn)行純化和濃縮。該法可濃縮濃度極低的抗原，并可在電泳和免疫印跡之前將其與無關(guān)的蛋白質(zhì)分離， 使對極低濃度抗原的研究成為可能。其他提高檢測靈敏度的方法都是針對增強(qiáng)信號本身強(qiáng)度設(shè)計的，其中第3頁共4頁包括使用信號更

13、好和更強(qiáng)的熒光試劑或使條帶局部酶的活性增強(qiáng)。3.IBT法在臨床應(yīng)用中存在一定的局限性本法綜合了 SDS-PAGE勺高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在 艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗。當(dāng)血清HIV抗體陽性時，抗體結(jié)合到膜上的病毒蛋白上，最后用放射性核素標(biāo)記的抗人IgG檢測。如能檢測出 HIV蛋白抗原即為陽性，如僅p24陽性，則結(jié)果可疑，就對原標(biāo)本重判。WB式驗?zāi)軝z測到gpl20、p66、p51、gp41、p31、p24和17kD的抗原。其敏感性較 ELISA高，但 比RIPA差。并可用HIV-1和HIV-2劃分，由于自身抗體的存在，仍有假陽性。六、放射免疫沉淀試驗（RIPA）以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法，同時彌補(bǔ)了免疫印跡法的不足。【習(xí)題】免疫印跡法區(qū)帶顯色常用的底物是A. 鄰苯二胺B. 四甲基聯(lián)苯胺C. ABTSD. 對硝基苯磷酸酯E. 3 , 3-二氨基聯(lián)苯胺正確答案E答