食品應(yīng)用生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、項(xiàng)目一 產(chǎn)纖溶酶菌株的篩選纖溶酶是大豆發(fā)酵過(guò)程中由微生物分泌的一種蛋白水解酶，在酶學(xué)分類(lèi)上有些是絲氨酸蛋白酶，有些是金屬蛋白酶，具有能直接降解血栓纖維蛋白，并不降解血漿纖維蛋白原，可口服，經(jīng)消化道直接吸收，安全可靠，在人體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，不易引起體內(nèi)出血等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是潛在的、安全的溶栓劑。一、基本原理能夠產(chǎn)生纖溶酶的菌株在初篩平板上生長(zhǎng)后，其菌落周?chē)尚纬擅黠@的蛋白水解圈。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)用選擇平板分離纖溶酶產(chǎn)生菌的方法，獲得產(chǎn)纖溶酶菌株。三、實(shí)驗(yàn)器材1. 原料豆豉或納豆2. 溶液和試劑蛋白胨，牛肉膏，瓊脂粉，氯化鈉，酪蛋白，營(yíng)養(yǎng)瓊脂，葡萄糖等。3. 儀器和用品三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒

2、，培養(yǎng)搖床，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器四、操作步驟1. 初篩培養(yǎng)基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，瓊脂粉2.02. 菌種保存斜面的配制（%）：葡萄糖0.5，營(yíng)養(yǎng)瓊脂 3.5。分裝成若干支試管，試管上帶棉塞。（每人3支試管）3. 培養(yǎng)基與器皿（1.5 mL離心管60個(gè)，無(wú)菌水100 mL）的滅菌121，滅菌15 min4. 菌液的制備分別稱取3 g原料于研缽中，加入10 mL無(wú)菌水研碎后，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，迷你離心機(jī)離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至試管中，備用。5. 菌液的梯度稀釋與劃線移取上述菌液0.5 mL至4.5 mL無(wú)菌水中，制成10-1菌液，依次類(lèi)推

3、，制成10-2，10-3，10-4菌液，分別將10-3，10-4菌液涂布到初篩培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度涂布2塊平板，分別放入28、35培養(yǎng)20 h左右觀察結(jié)果。用接種環(huán)從實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一的平板上選擇一個(gè)能產(chǎn)水解圈的菌株在選擇平板上劃線分離。（每人劃12個(gè)平板）6. 產(chǎn)纖溶酶菌株的分離純化7. 產(chǎn)纖溶酶菌株的菌落形態(tài)觀察及菌種保存將上述劃線后的平板放入37培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，將平板拍照，接種其中最為典型的菌株劃線保存在試管斜面上；觀察產(chǎn)纖溶酶菌株在選擇平板上的菌落形態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行描述。項(xiàng)目二 產(chǎn)纖溶酶菌株的酶活測(cè)定一、基本原理1. 不同類(lèi)型的纖溶酶都能在初篩平板上形成水解圈，細(xì)菌在平板上的生長(zhǎng)條件和液體環(huán)

4、境中生長(zhǎng)的情況相差很大，因此在平板上產(chǎn)圈能力強(qiáng)的菌株不一定就是纖溶酶的高產(chǎn)菌株，因此要進(jìn)行酶活測(cè)定復(fù)篩。2. 蛋白酶對(duì)酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類(lèi)化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鎢蘭和鎢蘭混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來(lái)間接測(cè)定蛋白酶的活力。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)采用福林試劑測(cè)定纖溶酶活力。三、實(shí)驗(yàn)器材1. 原料產(chǎn)纖溶酶菌株2. 溶液和試劑蛋白胨，牛肉膏，瓊脂粉，氯化鈉，干酪素，三氯乙酸，N

5、aOH，Na2CO3，F(xiàn)olin試劑，硼砂，酪氨酸，蒸餾水等。3. 儀器和用品三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器四、操作步驟1. 選擇平板的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌15 min。（200 mL2）預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（楊華、王金新）2. 擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，15150的試管裝6 mL，121，滅菌15 min。（150 mL，分裝成25支試管，每6 7支一包）預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（楊華、王金新）3. 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制（%）：大豆蛋白胨1.0，牛肉膏

6、0.3，氯化鈉0.5，酪蛋白2.0，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌15 min。（1200 mL，分裝成24個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（楊華、王金新）4. 菌液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)16 h，4，5000 rpm離心10 min，取上清液用于纖溶酶活力的測(cè)定。5. pH7.2磷酸緩沖液的制備 預(yù)備實(shí)驗(yàn)2（鄧海、張娟）取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸餾水稀釋1

7、倍，即為pH7.2磷酸緩沖液。A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。 6. Folin試劑的配制 預(yù)備實(shí)驗(yàn)2（鄧海、張娟）6.1 Folin試劑在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 mL蒸餾水，再加10 mL85%磷酸，20 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h?；亓鹘Y(jié)束時(shí)，加入30g 硫酸鋰，10 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15 mi

8、n，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，定容至200 mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。6.2 Folin試劑使用液使用前，將Folin試劑與水按1:2稀釋。7. 0.4 mol/L碳酸鈉溶液的配制 預(yù)備實(shí)驗(yàn)3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取無(wú)水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。8. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 預(yù)備實(shí)驗(yàn)3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。9. 0.5 mol/L的NaOH的配制 預(yù)備

9、實(shí)驗(yàn)3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取2 g NaOH溶解并定至100 mL。10. 20.00 mg/mL干酪素溶液 預(yù)備實(shí)驗(yàn)3（瞿格格、喻順華）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤(rùn)濕，加入約80 mLpH7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。11. 100 g/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 預(yù)備實(shí)驗(yàn)3（瞿格格、喻順華）準(zhǔn)確稱取預(yù)先于105干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，用1 mol/L的鹽酸60 mL 溶解后定容

10、至100 mL，即為1.00 mg/mL的酪氨酸溶液。吸取1.00 mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL，即得100.0 g/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。12. 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用100 g/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制0100 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。試管號(hào)012345取 100 g/mL 酪氨酸溶液（ mL ）0246810蒸餾水（ mL ）1086420酪氨酸實(shí)際濃度（g/mL ）020406080100取上述不同濃度的酪氨酸1 mL與5 mL 0.4 mol/L Na2CO3、1 mL Folin試劑混合，40 水浴顯色30

11、min，680 nm測(cè)定吸收值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試管號(hào)012345取不同濃度的酪氨酸溶液（ mL ）10.4 mol/L Na2CO3（ mL ）5Folin試劑140 水浴顯色30 min取出用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680 nm比色，以不含酪氨酸的0管為空白調(diào)零，分別測(cè)定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。計(jì)算出當(dāng)OD為1時(shí)的酪氨酸的量（g），即為吸光常數(shù)K值，其K值應(yīng)在95100范圍內(nèi)。 13. 樣品測(cè)定 13.1 先將干酪素溶液放入400.2恒溫水浴中，預(yù)熱5 min。13.2 取4支試管，各加入1 mL酶液。13.3 取一支作為空白管，加2 mL三氯

12、乙酸，其他3管作為測(cè)試管各加入1 mL干酪素，搖勻，40保溫10 min。13.4 取出試管，3支測(cè)試管中各加入2 mL三氯乙酸，空白管中加1 mL干酪素。 13.5 靜置10 min，使蛋白質(zhì)完全沉淀，然后用濾紙過(guò)濾沉淀。13.6 各取1 mL濾液，分別加0.4 mol/L的 Na2CO3 5 mL、Folin試劑1 mL。在40顯色30 min。680 nm處測(cè)OD值。 以空白管調(diào)零點(diǎn)。 五、結(jié)果計(jì)算 1. 酶活定義 1g固體酶粉（或1mL液體酶），在40（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5）條件下，1 min水解干酪素產(chǎn)生1 g酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。 2. 計(jì)算酶的

13、活性單位依據(jù)以下公式 蛋白酶的活力= AK4/10n U/g(mL) A：樣品平行試驗(yàn)的平均OD值 K：吸光常數(shù) 4：反應(yīng)試劑的總體積 10：酶解反應(yīng)時(shí)間 n：酶液稀釋總倍數(shù)項(xiàng)目三 碳源對(duì)菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實(shí)驗(yàn)材料1. 實(shí)驗(yàn)原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂粉、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、麥芽糖、甘露糖、果糖、甘露醇、玉米淀粉、大豆粉、四棱豆粉，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，F(xiàn)olin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、滅菌鍋。二、實(shí)驗(yàn)操作步驟1

14、. 培養(yǎng)基制備（1）選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劉炎平、申超凡）（2）擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 mL，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（劉炎平、申超凡）（3）發(fā)酵培養(yǎng)基1的配制（%）：葡萄糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（4）發(fā)酵培養(yǎng)基2的配制（%）：蔗糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，

15、250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（5）發(fā)酵培養(yǎng)基3的配制（%）：可溶性淀粉 2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（6）發(fā)酵培養(yǎng)基4的配制（%）：干酪素 2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（7）發(fā)酵培養(yǎng)基5的配制（%）：玉米淀粉2.0，

16、蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（8）發(fā)酵培養(yǎng)基6的配制（%）：麥芽糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（9）發(fā)酵培養(yǎng)基7的配制（%）：甘露醇2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（10）發(fā)酵培養(yǎng)基8的配制（

17、%）：糊精2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（11）發(fā)酵培養(yǎng)基9的配制（%）：果糖2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（12）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：四菱豆粉2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（1

18、3）發(fā)酵培養(yǎng)基11的配制（%）：大豆粉2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）2. Folin試劑的配制 2.1 Folin試劑在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 mL蒸餾水，再加10 mL85%磷酸，20 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h。回流結(jié)束時(shí)，加入30g 硫酸鋰，10 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至2

19、00mL容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，定容至200 mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 Folin試劑使用液使用前，將Folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/L碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無(wú)水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。5. 0.5 mol/L的NaOH的配制 準(zhǔn)確稱取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. pH7.2磷酸緩沖液的制備 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為pH

20、7.2磷酸緩沖液。A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制備 預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劉炎平、申超凡）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤(rùn)濕，加入約80 mLpH7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液

21、在冰箱內(nèi)貯存。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 mL不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測(cè)定取粗酶液1mL，按照福林試劑法測(cè)定其纖溶酶活力，研究碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響，通過(guò)酶活力確定最佳碳源。項(xiàng)目四 氮源對(duì)菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實(shí)驗(yàn)材料1. 實(shí)驗(yàn)原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂粉、葡萄糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵

22、母膏(粉)、牛肉膏(粉)、干酪素、硝酸鉀、硝酸銨、脲素、硝酸鈉，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，F(xiàn)olin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、滅菌鍋。二、實(shí)驗(yàn)操作步驟1. 培養(yǎng)基制備（1）選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)（鄒白玲、黃云虹）（2）擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 mL，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（鄒白玲、黃云虹）（3）發(fā)

23、酵培養(yǎng)基1的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（4）發(fā)酵培養(yǎng)基2的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，大豆蛋白胨2.0，氯化鈉0.5， 250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（5）發(fā)酵培養(yǎng)基3的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，胰蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 m

24、L三角瓶，50 mL/三角瓶）（6）發(fā)酵培養(yǎng)基4的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，酵母膏(粉)2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（7）發(fā)酵培養(yǎng)基5的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，牛肉膏(粉)2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（8）發(fā)酵培養(yǎng)基6的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，干酪素2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 m

25、in。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（9）發(fā)酵培養(yǎng)基7的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，硝酸鉀2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（10）發(fā)酵培養(yǎng)基8的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，硝酸銨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（11）發(fā)酵培養(yǎng)基9的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，脲素2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為

26、50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（12）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，硝酸鈉2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（13）發(fā)酵培養(yǎng)基11的配制（%）：最優(yōu)碳源 2.0，大豆蛋白胨1.0，牛肉膏 1.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）2. Folin試劑的配制 2.1 Folin試

27、劑在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 mL蒸餾水，再加10 mL85%磷酸，20 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h?；亓鹘Y(jié)束時(shí)，加入30g 硫酸鋰，10 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，定容至200 mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 Folin試劑使用液使用前，將Folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/L碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無(wú)水碳酸

28、鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。5. 0.5 mol/L的NaOH的配制 準(zhǔn)確稱取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. pH7.2磷酸緩沖液的制備 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為pH7.2磷酸緩沖液。A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL

29、。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制備 預(yù)備實(shí)驗(yàn)（鄒白玲、黃云虹）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤(rùn)濕，加入約80 mLpH7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 mL不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培

30、養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測(cè)定取粗酶液1mL，按照福林試劑法測(cè)定纖溶酶活力，研究氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，通過(guò)酶活力確定最佳氮源。項(xiàng)目五 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實(shí)驗(yàn)材料1. 實(shí)驗(yàn)原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂粉、葡萄糖、胰蛋白胨、K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaC12，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，F(xiàn)olin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、滅菌鍋。二、實(shí)驗(yàn)

31、操作步驟1. 選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)（周維、丁超）2. 擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，胰蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 mL，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（周維、丁超）3. L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表K2HPO4(%)KH2PO4(%)MgSO4(%)CaC12(%)10.050.050.025020.10.10.050.0230.150.150.0750.044. L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表K2HPO4(%)KH2PO4(%)MgSO4(%)CaC1

32、2(%)11(0.05)1(0.05)1(0.025)1(0)21(0.05)2(0.1)2(0.05)2(0.02)31(0.05)3(0.15)3(0.075)3(0.04)42(0.10)1(0.05)2(0.05)3(0.04)52(0.1)2(0.1)3(0.075)1(0)62(0.1)3(0.15)1(0.025)2(0.02)73(0.15)1(0.05)3(0.075)2(0.02)83(0.15)2(0.1)1(0.025)3(0.04)93(0.15)3(0.15)2(0.05)1(0)5. 發(fā)酵培養(yǎng)基的制備（1）培養(yǎng)基1(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2H

33、PO4 0.1，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.025，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（2）培養(yǎng)基2(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.05，CaC12 0.02，250 mL三角瓶裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（3）培養(yǎng)基3(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.1，KH2PO4 0.3，MgSO4 0.075，CaC12 0.04，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（4）培養(yǎng)基4(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白

34、胨2.0，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.05，CaC12 0.04，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（5）培養(yǎng)基5(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.075，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（6）培養(yǎng)基6(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.2，KH2PO4 0.3，MgSO4 0.025，CaC12 0.02，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（7）培養(yǎng)基7(%)：可溶性淀

35、粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.3，KH2PO4 0.1，MgSO4 0.075，CaC12 0.02，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（8）培養(yǎng)基8(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.3，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.025，CaC12 0.04，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（9）培養(yǎng)基9(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，K2HPO4 0.3，KH2PO4 0.3，MgSO4 0.05，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（10）發(fā)酵

36、培養(yǎng)基10的配制（%）：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（11）培養(yǎng)基11(%)：可溶性淀粉 2.0，胰蛋白胨2.0，酵母膏 0.5，氯化鈉0.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。2. Folin試劑的配制 2.1 Folin試劑在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 mL蒸餾水，再加10 mL85%磷酸，20 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10 h?；亓鹘Y(jié)束時(shí)，加入30g 硫酸鋰，10 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15

37、min，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，定容至200 mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 Folin試劑使用液使用前，將Folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/L碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無(wú)水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。5. 0.5 mol/L的NaOH的配制 準(zhǔn)確稱取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. p

38、H7.2磷酸緩沖液的制備 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為pH7.2磷酸緩沖液。A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制備 預(yù)備實(shí)驗(yàn)（周維、丁超）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤(rùn)濕，加入約80 mLpH7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱

39、邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。配制2瓶，各100 mL。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 mL不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測(cè)定取粗酶液1mL，按照福林試劑法測(cè)定纖溶酶活力，研究各培養(yǎng)基中纖溶酶活力的大小，確定最佳無(wú)機(jī)離子。項(xiàng)目六 起始pH對(duì)菌株產(chǎn)纖溶酶活力的影響一、實(shí)驗(yàn)材

40、料1. 實(shí)驗(yàn)原料：高產(chǎn)豆豉纖溶酶菌株2. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、干酪素、瓊脂粉、葡萄糖、胰蛋白胨，三氯乙酸，NaOH，Na2CO3，F(xiàn)olin試劑，蒸餾水等。3. 器皿：三角瓶，培養(yǎng)皿，吸管，試管，涂布棒，高壓滅菌鍋，天平、振蕩混合器、具塞比色試管等。4. 儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、滅菌鍋。二、實(shí)驗(yàn)操作步驟1. 選擇平板的配制（%）：蛋白胨1.0，牛肉膏0.3，氯化鈉0.5，干酪素 2.0，瓊脂粉2.0，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)（劉雅麗、李艷梅）2. 擴(kuò)大培養(yǎng)基的配制（%）：葡萄糖1.0，胰蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，15150的試管裝6 mL，121，滅菌20 min。預(yù)備實(shí)驗(yàn)

41、1（劉雅麗、李艷梅）3. 1 mol/L HCl 50 mL預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（劉雅麗、李艷梅）4. 1 mol/L NaOH 50 mL預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（劉雅麗、李艷梅）5. 發(fā)酵培養(yǎng)基1的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH 至4.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）4. 發(fā)酵培養(yǎng)基2的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH 至5.0，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三

42、角瓶，50 mL/三角瓶）（3）發(fā)酵培養(yǎng)基3的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH 至5.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（4）發(fā)酵培養(yǎng)基4的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH 至6.0，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（5）發(fā)酵培養(yǎng)基5的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH 至6.5，25

43、0 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（6）發(fā)酵培養(yǎng)基6的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的鹽酸溶液或1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 至7.0，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（7）發(fā)酵培養(yǎng)基7的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 至7.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL

44、三角瓶，50 mL/三角瓶）（8）發(fā)酵培養(yǎng)基8的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 至8.0，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（9）發(fā)酵培養(yǎng)基9的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 至8.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（10）發(fā)酵培養(yǎng)基10的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)p

45、H 至9.0，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）（11）發(fā)酵培養(yǎng)基11的配制（%）：經(jīng)前幾次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 至9.5，250 mL三角瓶的裝瓶量為50 mL，121，滅菌20 min。（150 mL，分裝成3個(gè)250 mL三角瓶，50 mL/三角瓶）2. Folin試劑的配制 2.1 Folin試劑在250 mL磨口回流瓶中，加入20 g鎢酸鈉，5 g鉬酸鈉及140 mL蒸餾水，再加10 mL85%磷酸，20 mL濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流

46、10 h?；亓鹘Y(jié)束時(shí)，加入30g 硫酸鋰，10 mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15 min，以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，用少量蒸餾水洗滌回流瓶，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至200mL容量瓶，定容至200 mL，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。2.2 Folin試劑使用液使用前，將Folin試劑與水按1:2稀釋。3. 0.4 mol/L碳酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取無(wú)水碳酸鈉42.4 g，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。4. 0.4 mol/L的三氯乙酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取65.4三氯乙酸，以蒸餾水溶解定溶至1000 mL。5. 0

47、.5 mol/L的NaOH的配制 準(zhǔn)確稱取2 g NaOH溶解并定至100 mL。6. pH7.2磷酸緩沖液的制備 取28mLA液、72 mL B液混合后，用蒸餾水稀釋1倍，即為pH7.2磷酸緩沖液。A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液）稱取31.2 g NaH2PO3.2H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液）稱取71.6 g Na2HPO3.12H2O，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL。7. 20.00 mg/mL干酪素溶液的制備 預(yù)備實(shí)驗(yàn)1（劉雅麗、李艷梅）稱取干酪素2.000 g，準(zhǔn)確至0.001 g，用少量的0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液

48、(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2 3滴)潤(rùn)濕，加入約80 mLpH7.2磷酸緩沖液，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的緩沖液稀釋至刻度，此溶液在冰箱內(nèi)貯存。配制2瓶，各100 mL。8. 粗酶液的制備用接種環(huán)從試管斜面上挑取一環(huán)菌株，在選擇平板上劃線，37倒置培養(yǎng)20 h，挑選有明顯水解圈的單菌落轉(zhuǎn)接入試管擴(kuò)大培養(yǎng)液中37震蕩培養(yǎng)6 h，按2%的比例分別轉(zhuǎn)接入裝有50 mL不同發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶）繼續(xù)37震蕩培養(yǎng)20 h，4，5000 rpm離心10 min，收集上清液為粗酶液。9. 酶活的測(cè)定取粗酶液1mL，按照福林試劑法測(cè)定纖溶酶活力，研究各培養(yǎng)基中纖溶酶活力的大小，確定最佳無(wú)機(jī)離子。項(xiàng)目七 芽孢桿菌BE1304生長(zhǎng)曲線及其產(chǎn)溶酶活力變化曲線的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)材料1. 實(shí)驗(yàn)原料：高產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌BE13042. 試劑：蛋白胨、牛肉膏、氯