低溫生物學(xué)課程教學(xué)大綱

1、低溫生物學(xué)課程教學(xué)大綱課程負(fù)責(zé)人：鄭從義課程中文名稱:低溫生物學(xué)課程英文名稱：Cryobiology課程類別：選修課程學(xué)分?jǐn)?shù)：2學(xué)分課程學(xué)時數(shù)：36學(xué)時授課對象：生科院研究生本課程的前導(dǎo)課程：生物學(xué)一、 教學(xué)目的1) 了解低溫生物學(xué)的研究進(jìn)展2) 掌握低溫生物學(xué)的基本研究技術(shù)與技能二、 教學(xué)要求1) 通過多媒體、Powerpoint教學(xué)課件組織教學(xué)，使教學(xué)內(nèi)容豐富多彩、教學(xué)語言簡短規(guī)范。2) 推行教學(xué)相長的教學(xué)形式，采取課堂教學(xué)與課后討論相結(jié)合，要求學(xué)生邊學(xué)習(xí)、邊消化、不斷總結(jié)、舉一反三。三、 教學(xué)內(nèi)容1. 緒論1. 1低溫生物學(xué)的定義低溫生物學(xué)研究自然或人工低溫條件下生命不同層次變化規(guī)律的科

2、學(xué)。它既是生命科學(xué)，又是技術(shù)科學(xué)。學(xué)科發(fā)展以細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)為基礎(chǔ)，物理、化學(xué)、低溫工程、計算機(jī)技術(shù)為依托，是一門理工交叉學(xué)科。現(xiàn)代低溫生物學(xué)研究生物個體的低溫生存環(huán)境，離體生物材料的低溫保存，植物的凍害及耐寒性，探索低溫?fù)p傷機(jī)理，發(fā)掘低溫抗凍物質(zhì)，實(shí)施冷凍醫(yī)療，從而闡明低溫條件下生命現(xiàn)象的特征及其本質(zhì)。1. 2低溫生物學(xué)研究范疇低溫生物學(xué)研究進(jìn)展較快，研究范疇涉及生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的方方面面。對自然狀態(tài)下的生物耐寒性、低溫冷休克的理論研究，生物材料冷凍保存以維持包括高等生物在內(nèi)的細(xì)胞、組織、器官以及個體的生活狀態(tài)的應(yīng)用研究，低溫醫(yī)學(xué)的理論與應(yīng)用研究等均

3、是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。如按學(xué)科分類，其研究范疇包括： 低溫微生物（10以下正常生長的微生物）微生物低溫生物學(xué) 極地微生物（南、北極存在的微生物） 菌種保存 人和動物的低溫凍傷、低溫冷休克 動物冬眠 低溫免疫動物及其材料的低溫生物學(xué) 動物細(xì)胞保存 動物胚胎保存 動物精子保存 原生動物保存 植物的耐寒與抗凍植物材料低溫生物學(xué) 植物種質(zhì)資源保存與利用 植物材料的低溫保存 低溫生理（體溫過低癥、低溫麻醉、低溫酶學(xué)）低溫醫(yī)學(xué) 低溫保存（治療性細(xì)胞、組織、器官保存） 冷凍醫(yī)療（冷凍治療、冷凍器械）冷凍醫(yī)療器具的設(shè)計、制造冷凍醫(yī)療器械的工程學(xué) 低溫保存設(shè)備、儀器的設(shè)計制造 冷凍醫(yī)療的理論基礎(chǔ)低溫生物傳熱的工程物

4、理學(xué) 冷凍醫(yī)療器械設(shè)計理論依據(jù) 水凍結(jié)的理論依據(jù) 生物材料保存的熱物理問題 低溫保護(hù)劑應(yīng)用的理論基礎(chǔ)1.3 低溫生物學(xué)研究的進(jìn)展1.3.1玻璃化冷凍保存新技術(shù)的研究與應(yīng)用玻璃化冷凍保存新技術(shù)是一種將生物材料（細(xì)胞）與保護(hù)劑溶液混合以足夠快的降溫速率過冷至玻璃化溫度，使其固化形成冷凍玻璃態(tài)（非晶態(tài)）而達(dá)到長期凍存的目的。由于在冷凍過程中，避免了細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，減少了冷凍過程對細(xì)胞的損傷，使得小鼠胚胎，植物細(xì)胞、愈傷組織、莖尖等難于凍存的生物材料可以有效凍存。因此，玻璃化凍存技術(shù)成為20世紀(jì)90年代低溫生物學(xué)研究中一項(xiàng)重要的冷凍保藏新技術(shù)被應(yīng)用。90年代中期，我們找準(zhǔn)了國際上研究的這一主流方向

5、，結(jié)合自己的實(shí)際情況，制定切實(shí)可行的研究計劃，與楊弘遠(yuǎn)院士實(shí)驗(yàn)室、中南林業(yè)大學(xué)等實(shí)驗(yàn)室合作，開展了植物細(xì)胞，植物愈傷組織、植物花粉等生物材料的玻璃化保藏研究，并積極向國家申請課題，最終獲得國家教委重點(diǎn)資金項(xiàng)目資助，使研究計劃步入正軌。經(jīng)過不懈的努力，在動物細(xì)胞、植物愈傷組織、植物花粉的玻璃化凍存技術(shù)方面均取得突破，建立了自主知識產(chǎn)權(quán)的技術(shù)規(guī)范。尤其是玻璃化溶液配方、過冷條件、玻璃化形成效率等技術(shù)指標(biāo)具有中國特色，研究成果得到國內(nèi)外同行的認(rèn)可，產(chǎn)生了較明顯的經(jīng)濟(jì)效益。1.3.2動物細(xì)胞冷休克研究的起步與發(fā)展20世紀(jì)90年代中期，低溫生物學(xué)基礎(chǔ)研究取得重大突破，為研究細(xì)胞冷休克產(chǎn)生機(jī)制奠定了理論基

6、礎(chǔ)，使得細(xì)胞冷休克產(chǎn)生機(jī)制成為研究熱點(diǎn)之一。我的研究工作幾乎是同時起步，經(jīng)過幾年的努力，目前研究取得較大進(jìn)展，初步闡明了動物細(xì)胞冷休克產(chǎn)生的動力學(xué)特征，比較了人體細(xì)胞與昆蟲細(xì)胞冷休克差異性，證明了昆蟲細(xì)胞（Sf9）在04具有冷休克適應(yīng)性等。尤其是冷休克誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及其動力學(xué)特征的研究形成特色，通過應(yīng)用掃描電鏡觀察、末端DNA轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧UTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）和流式細(xì)胞術(shù)研究低溫冷休克誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡，并對其細(xì)胞凋亡的動力學(xué)特征測定、分析。結(jié)果顯示：5、0、4冷休克均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡進(jìn)程受實(shí)驗(yàn)細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)時間，冷休克溫度、時間，細(xì)胞冷休克后恢復(fù)培養(yǎng)時間的影

7、響，這些影響因素具有明顯的動力學(xué)特征。經(jīng)過冷休克誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的動力學(xué)特征分析、比較，優(yōu)選出研究冷休克誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)體系：即細(xì)胞經(jīng)37預(yù)培養(yǎng)36h冷休克（524h、036h、448h）細(xì)胞冷休克后于37恢復(fù)培養(yǎng)1824h細(xì)胞凋亡檢測檢測結(jié)果綜合分析。應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)體系可使細(xì)胞凋亡率達(dá)5060，且重復(fù)性尚佳。優(yōu)化體系為深入研究冷休克誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號傳遞及其分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。參考這一實(shí)驗(yàn)研究模型，我們研究了冷休克對不同來源腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生與發(fā)展，獲得一組組非常有用的數(shù)據(jù)，使這一研究在國內(nèi)處于較高的水平，發(fā)表研究論文10余篇。1.4 低溫生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問題1.4.1抗凍蛋白基因克隆、

8、表達(dá)與應(yīng)用抗凍蛋白（Antifreeze proteins），亦稱熱滯蛋白，是一類抑制冰晶生長的蛋白質(zhì)，能以非依數(shù)形式降低水溶液的冰點(diǎn)，而對熔點(diǎn)影響甚微，致使水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)間出現(xiàn)差值，從而達(dá)到抗凍的目的?？箖龅鞍鬃钤绨l(fā)現(xiàn)于極地魚類，隨后在一些節(jié)肢動物、昆蟲、植物和細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)已證明，雖然抗凍蛋白的抗凍活性基本相同，功能也比較接近，但不同物種來源的抗凍蛋白其組成、結(jié)構(gòu)差異顯著?？梢姡箖龅鞍谆钚浴⒐δ苤饕憩F(xiàn)在蛋白折疊構(gòu)象和特殊基因上。這是一類極為特殊的蛋白質(zhì)，其在生物體內(nèi)或細(xì)胞中的合成受環(huán)境溫度的影響，是動物自我調(diào)節(jié)的應(yīng)急蛋白質(zhì)，在低溫生理適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。鑒于抗凍蛋白在胚胎、

9、細(xì)胞、組織、器官等生物材料的保存中具有延滯冰晶形成，保護(hù)細(xì)胞免受損傷的作用，因此，已有用抗凍蛋白替代化學(xué)試劑作為低溫保護(hù)劑的研究報道，證明了抗凍蛋白的保護(hù)作用。問題在于其成本過高，廣泛應(yīng)用存在一定問題。迄今，抗凍蛋白研究的前沿集中在抗凍蛋白基因的克隆與表達(dá)，諸如魚類afp基因、植物afp基因、昆蟲afp基因和細(xì)菌afp基因都先后被克隆與表達(dá)。這些基因的克隆與表達(dá)，對研究抗凍蛋白的抗凍活性，結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要意義，近年已取得進(jìn)展，在今后幾年內(nèi)將會有重大突破。1.4.2器官的長期保存與應(yīng)用隨著免疫抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，移植免疫排斥問題得到有效的控制，使得多種器官移植的成功率顯著提高，對器

10、官的需求率大增，器官的供求矛盾日趨突出。這給低溫生物學(xué)研究提出了更高的要求，解決器官的長期保存問題迫在眉睫。然而，器官的長期保存還有很多理論問題急需解決，技術(shù)手段待建立及完善，這些問題促使國內(nèi)外低溫生物學(xué)家去探索，也成為21世紀(jì)需要突破的熱點(diǎn)問題。2. 低溫生物學(xué)基礎(chǔ)2.1物理及化學(xué)基礎(chǔ)2.1.1低溫保存與低溫?fù)p傷.1 低溫保存1)溫度 4 40 80 196 紅細(xì)胞 12年 動物細(xì)胞 40年2)冷凍速率 細(xì)胞密度 細(xì)胞體積 細(xì)胞表面積 保護(hù)劑種類 保護(hù)劑濃度3)凍存溫度 80 196 060危險溫度4)復(fù)溫 37405)稀釋、培養(yǎng)6)檢測2.1.1.2 低溫?fù)p傷1) 胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶造成的損傷冷

11、卻越快，損傷越大，形成胞內(nèi)冰晶2) 溶質(zhì)損傷慢冷，無胞內(nèi)冰晶形成，溶質(zhì)濃度改變，細(xì)胞收縮，胞內(nèi)水分滲出3) 造成冷凍損傷的重要因素 保護(hù)劑的種類、濃度，加入、移出的方式 過高的保存溫度60不可取，微小冰晶，再結(jié)晶損傷 預(yù)凍條件A. 微生物凍干預(yù)凍B. 動物細(xì)胞材料預(yù)凍 解凍條件2.1.2 溶液的凍結(jié)特性與細(xì)胞的損傷2.1.2.1水的凍結(jié)特性冰晶形成的影響.2溶液的凍結(jié)特性 溶質(zhì)濃度 溶質(zhì)種類 配比 性質(zhì)2.1.3 低溫保護(hù)劑和凍存液.1 保護(hù)劑 滲透型：二甲亞砜、甘油 非滲透型：葡聚糖、羥基淀粉、聚乙烯吡咯酮.2凍存液 電解質(zhì)（鹽） 組成 高滲液（脫水）營養(yǎng)液 注意事項(xiàng)： pH值、活性分子（蛋

12、白質(zhì)）2.1.4 玻璃化保存液與玻璃化玻璃化：液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷w態(tài)的固化過程。正常情況下，液體凍結(jié)時產(chǎn)生規(guī)則的晶體或部分晶體，易造成對活細(xì)胞的直接損傷。溶液的玻璃化 原則 高濃度易形成玻璃化，對細(xì)胞不利溫度（低溫操作） 比例 溫度2.2 工程基礎(chǔ) 儀器與設(shè)備.1液氮容器 常規(guī)使用：貯存型、運(yùn)輸型 自動化管理.2低溫冰箱 40以上 80.3程控降溫儀 種類 精度 使用范圍.4凍干機(jī) 種類 精度 使用范圍 凍干程度3低溫生物學(xué)的基本技術(shù)3.1目的1) 保持動物細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性2) 防止外源因子的污染3.2 動物細(xì)胞系保藏的標(biāo)準(zhǔn)程序3.3 動物細(xì)胞系凍存前期工作1) 凍存管的準(zhǔn)備2) 凍存液的制備保

13、護(hù)劑 培養(yǎng)液 pH值 溫度3) 胰酶4) 培養(yǎng)基5) 血清6) 生長因子7) 抗生素3.4 動物細(xì)胞系的凍存程序1) 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代懸浮細(xì)胞 貼壁細(xì)胞2) 細(xì)胞的收集與濃度調(diào)整細(xì)胞收集 細(xì)胞計數(shù)3) 細(xì)胞凍存液的配制保護(hù)劑濃度 配制原則4) 凍存懸浮細(xì)胞的制備5) 分裝6) 凍存一般凍存方法 標(biāo)準(zhǔn)凍存方法7) 質(zhì)量控制細(xì)胞活性檢測 細(xì)胞污染檢測8) 凍存程序小結(jié)3.5 動物細(xì)胞系質(zhì)量控制1) 細(xì)菌、真菌污染檢測2) 支原體污染檢測3) 病毒污染檢測4. 參考文獻(xiàn)1. Graham L A.1997, Hyperactive antifreeze protein from bettle. Sc

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