家兔關(guān)節(jié)腔中微透析探針植入方法的建立及應(yīng)用

1、家兔關(guān)節(jié)腔中微透析探針植入方法的建立及應(yīng)用邵繼征1，田瑤2，周莉玲2(1、廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州，510520；2、廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州，510006)摘要目的 建立家兔關(guān)節(jié)腔中微透析探針的植入方法，并考察其應(yīng)用于家兔膝關(guān)節(jié)局部藥動學(xué)研究中的可行性。方法 將微透析探針在注射針頭、引導(dǎo)導(dǎo)管的幫助下從家兔膝關(guān)節(jié)髕韌帶一側(cè)插入關(guān)節(jié)腔中，并用X-射線檢查探針活性透析膜在關(guān)節(jié)腔中的位置。以青藤堿為研究藥物，HPLC-MS為檢測方法同時進(jìn)行了家兔血液及關(guān)節(jié)腔局部青藤堿的藥動學(xué)研究。結(jié)果 微透析探針活性透析膜能準(zhǔn)確地進(jìn)入關(guān)節(jié)腔的腔隙中，并成功應(yīng)用于關(guān)節(jié)局部藥動學(xué)研究，得到主要藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)論 家兔關(guān)節(jié)腔

2、中微透析探針植入方法可行，位置準(zhǔn)確，應(yīng)用于關(guān)節(jié)局部藥動學(xué)研究中有明顯的優(yōu)勢。關(guān)鍵詞微透析；家兔；關(guān)節(jié)腔；局部藥動學(xué) A method and practical application to implant the microdialysis probe into rabbits knee joint capsule SHAO Ji-zheng1,TIAN Yao2,ZHOU Li-lin2(1.Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520,China;2.Guangzhou University of Chinese

3、 Medicine,Guangzhou,510006,China)Abstract: Objective To establish a method to implant the microdialysis probe into rabbits knee joint capsule, and apply the method for pharmacokinetics study in knee joint fluid of rabbit. Methods The microdialysis probe were implanted in rabbits knee joint capsule w

4、ith the help of syringe needle and guide catheter, and the position of the probe was verified by X-ray. Sinomenine was subject in the pharmacokinetics study, HPLC-MS was used to test the drug concentration in blood and knee joint fluid. Results The membrane window of the microdialysis probe was in r

5、abbits knee joint capsule, and the method to implant the microdialysis probe was applied for pharmacokinetics study successfully. Conclusion The method to implant the microdialysis probe was established, and microdialysis has evident advantages in pharmacokinetics study.Key words: Microdialysis; Rab

6、bit; Knee joint capsule; Pharmacokinetics微透析技術(shù)（microdialysis, MD）是從神經(jīng)化學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來的可以對內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物進(jìn)行實(shí)時取樣的新技術(shù)。它可在基本不干擾體內(nèi)正常生命過程的情況下進(jìn)行在體、實(shí)時和在線的長時間取樣。1972年，Delgado等1首次發(fā)表了真正意義上的關(guān)于“微透析”的文章。從此，微透析采樣技術(shù)被成功地廣泛應(yīng)用于多種部位，如腦2、血液3、肝4,基金項(xiàng)目廣東省自然科學(xué)基金（10451052005005581）；國家自然科學(xué)基金(30672669)作者簡介邵繼征，女，博士，講師，研究方向：中藥新劑型與新技術(shù)研究 E-m

7、ail:yg1110膽5、肺6等。目前國內(nèi)外將探針植入動物關(guān)節(jié)腔，對關(guān)節(jié)液中的藥物濃度或內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測的相關(guān)報(bào)道還非常少見。Yen-Hsuan Jean等7曾將線性微透析探針植入到大鼠的膝關(guān)節(jié)中檢測興奮性氨基酸的含量，Nada B.Lawand等8曾將CMA/20血液微透析探針植入到大鼠膝關(guān)節(jié)中檢測關(guān)節(jié)液中的谷氨酸和精氨酸。本文建立了家兔關(guān)節(jié)腔中探針的植入方法，并用X-射線對探針的位置進(jìn)行了確認(rèn)。以青藤堿為研究藥物，利用微透析技術(shù)同步考察了青藤堿凝膠劑經(jīng)皮給藥后血液和關(guān)節(jié)液中藥動學(xué)研究，為關(guān)節(jié)腔中微透析技術(shù)的應(yīng)用提供了植入方法的示范及局部藥動學(xué)研究方法的參考。1材料和方法11材料111

8、儀器線性探針：MD-2000 LM-10 Linear Microdialysis Probes，10mm and 5mm membrane window，cut-off 8k dalton，美國BAS公司生產(chǎn)，購于上海凱量電子科技有限公司；CMA/20探針：PC microdialysis membrane，10mm and 5mm membrane window，cut-off 20k dalton，瑞士CMA公司生產(chǎn)，購于北京泰德金生物技術(shù)開發(fā)中心；CMA/12探針：PC microdialysis membrane，4mm and 3 mm membrane window，cut-of

9、f 20k dalton，瑞士CMA公司生產(chǎn)，購于北京泰德金生物技術(shù)開發(fā)中心；X-射線拍攝儀：德國西門子公司生產(chǎn)，廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院放射科提供；TSQ Quantum ACCESS型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀、Xcalibur 2.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：美國賽默飛公司。112試藥色譜甲醇：美國默克公司；烏來糖：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肝素鈉：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；BaS：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；青藤堿對照品：購于中國藥品生物制品檢定所，批號：0774-200206；青藤堿凝膠劑：自制。113實(shí)驗(yàn)動物健康新西蘭家兔，4只，雌雄各半，體重2.0 kg-2.5 kg，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（

10、合格證號：SCXK粵2003-0001，粵監(jiān)證字2007A016)。12方法121探針類型的選擇 經(jīng)家兔膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)解剖后測量，關(guān)節(jié)腔部位的寬度不超過5mm，所以在選擇探針時，其活性透析膜長度不宜超過5mm。探針類型：本文選擇CMA/12，活性透析膜長度為4 mm的探針用于關(guān)節(jié)微透析中，見圖1。該類型的探針有一個鋼性的支撐桿，而且配套有鋼性的引導(dǎo)導(dǎo)管，為探針的植入提供了方便。圖1 CMA/12探針Fig1 CMA/12 microdialysis probe122植入方法 實(shí)驗(yàn)前用8%BaS溶液將膝關(guān)節(jié)處的兔毛脫凈。家兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉后固定于手術(shù)臺上，用一根普通注射器的注射針頭從脛

11、骨結(jié)節(jié)最高點(diǎn)與髕骨下緣連線之中點(diǎn)的髕韌帶兩側(cè)凹陷處斜向下45º刺入，感覺到明顯的突破感后拔出，將CMA/12探針引導(dǎo)導(dǎo)管從針孔處沿著同一角度旋轉(zhuǎn)著刺入，上下移動導(dǎo)管，確定沒有阻力后拔出引導(dǎo)導(dǎo)管中的金屬桿，將探針小心地插入引導(dǎo)導(dǎo)管中即可。探針植入關(guān)節(jié)腔后的狀態(tài)見圖2。123位置的確定微透析探針的活性透析膜部位是否準(zhǔn)確地植入到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，需要依靠一定的手段來確定。文獻(xiàn)中確定探針的活性透析膜的植入位置一般是通過組織學(xué)的方法進(jìn)行檢查 9-10，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)植入位置不正確的動物，數(shù)據(jù)棄之不用，也有用X-射線檢查探針的位置7。本文采用X-射線法檢驗(yàn)該植入方法的準(zhǔn)確性，植入后拍攝結(jié)果見圖3。 圖3

12、 X-射線確定探針的位置Fig3: verify the probe position by X-ray從拍攝的圖片中可以看出微透析探針的活性透析膜準(zhǔn)確地落在關(guān)節(jié)腔的腔隙中。從圖片中還可以看出關(guān)節(jié)腔的空間比較大，只要小心仔細(xì)地操作，不會引起太大的誤差。因此，該植入方法能準(zhǔn)確地將微透析探針植入到關(guān)節(jié)腔中，方法簡單、可靠。該部位的微透析探針植入方法的成功建立，是利用微透析技術(shù)進(jìn)行關(guān)節(jié)腔局部實(shí)時、連續(xù)采樣的基礎(chǔ)，使關(guān)節(jié)腔局部的采樣成為可能，為關(guān)節(jié)腔局部的藥動學(xué)及藥效學(xué)研究提供了方法借鑒。2 關(guān)節(jié)腔局部藥動學(xué)研究21動物實(shí)驗(yàn)方法家兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉后固定于手術(shù)臺上，將CMA/20血液微透析

13、探針植入家兔耳緣靜脈中，并用醫(yī)用膠布固定。將CMA/12微透析探針植入家兔膝關(guān)節(jié)腔中。將青藤堿凝膠劑均勻地涂抺在家兔膝關(guān)節(jié)脫毛部位，給藥劑量為150mg·kg-1，用無紡布進(jìn)行包扎。給藥結(jié)束后開始同時收集血液及關(guān)節(jié)腔微透析液，取樣間隔為1h，每次48µL，共收集24h。樣品采集完成后，將灌流液換成含藥的林格氏液，平衡1h后收集4份透析液，用作探針體內(nèi)回收率的測定。探針回收率的計(jì)算公式：（C灌流液-C透析液）/C灌流液×100%。22青藤堿的測定方法11色譜條件：色譜柱：Hypersil GOLD C18柱(150×2.1mm，3µm)；柱溫：2

14、5；流動相：甲醇-0.1%甲酸(30：70)；流速：0.2mL.min-1；進(jìn)樣體積：10µL。質(zhì)譜條件：離子源：大氣壓電噴霧離子源（APC-ESI源）；監(jiān)測模式：正離子選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；噴霧電壓：3.5kV；毛細(xì)管溫度：350；鞘氣壓力：25psi；輔助氣流速：5arb；用于定量分析的離子為m/z239和m/z181，兩個子離子的碰撞能量分別為25Hz和36Hz。 微透析樣品非常純凈，不需經(jīng)過任何前處理，可直接注入色譜-質(zhì)譜儀中進(jìn)行測定。3 藥動學(xué)結(jié)果測定各份微透析樣品中的藥物濃度后通過體內(nèi)回收率的校正得到真實(shí)的藥物濃度。藥物的真實(shí)濃度=藥物的測定濃度/體內(nèi)回收率，以青藤堿的

15、真實(shí)濃度對取樣時間作圖，得到血液及關(guān)節(jié)液中藥時曲線見圖4。由藥-時曲線圖可知，青藤堿凝膠劑經(jīng)皮給藥后，血液及關(guān)節(jié)液中的藥物濃度均較快達(dá)到峰值，而且維持平穩(wěn)的藥物濃度較長時間。但血液與關(guān)節(jié)液中的藥物濃度并不相等，且變化趨勢也有所差異，關(guān)節(jié)局部的藥物濃度更加平穩(wěn)，維持時間更長，有利于關(guān)節(jié)炎的治療。采用DAS2.0藥動學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)實(shí)測值與理論值的相關(guān)性、曲線擬合優(yōu)度、AIC、SIC等指標(biāo)，確定最佳房室模型，結(jié)果表明血液中符合二室模型，關(guān)節(jié)中符合一室模型，主要藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。表1：青藤堿在家兔血液及關(guān)節(jié)液中的藥動學(xué)參數(shù)(n=4)Tab1: Pharmacokinetics pa

16、rameters in blood and knee joint fluid of rabbits after sinomenine administration(n=4)ParametersValuebloodknee jointCmax（µg/mL）2.601.22Tmax(h)29AUC0-t(mg/L*h)43.9224.83AUC0-(mg/L*h)80.4839.20AUMC0-t(h)2*(µg/mL)493.69309.66AUMC0-(h)2*(µg/mL)2216.24890.37MRT(0-t)(h)11.2412.47MRT(0-)(h)2

17、7.5422.72VRT0-t(h)245.6343.58VRT0-(h)2586.95307.624討論目前多采用測定血漿藥物濃度的方法來了解青藤堿在動物體內(nèi)的吸收、分布情況，但僅以血藥濃度作為依據(jù)存在著一定的缺陷，因?yàn)榍嗵賶A在臨床上用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，該病的病變部位在關(guān)節(jié)部位，血藥濃度的變化不一定能真實(shí)反應(yīng)靶部位的藥物濃度的變化，兩個部位之間是否有聯(lián)系，有怎樣的聯(lián)系，還需進(jìn)一步研究。利用微透析技術(shù)可以同步進(jìn)行多個部位藥代動力學(xué)研究，可以了解血液和靶部位中藥物濃度變化的區(qū)別和聯(lián)系。從全血中分離血漿，經(jīng)過一系列的處理后測定得到的血漿藥物濃度代表的是血漿中的藥物總量，包括游離的和與血漿蛋白結(jié)

18、合的藥物，而蛋白結(jié)合的藥物只是藥物在體內(nèi)的貯存運(yùn)輸形式，真正起到治療作用的是游離的藥物。所以，測定游離的藥物濃度更有意義，而微透析技術(shù)采集的正是游離的藥物。由于取材的限制，研究動物關(guān)節(jié)腔中藥物濃度的動態(tài)變化還存在著一定的困難，目前，一般是在規(guī)定的時間點(diǎn)沖洗抽取關(guān)節(jié)液，測定關(guān)節(jié)液中的藥物濃度，但是這種方法的弊端就是動物用量大，一只動物只能得到一個時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，無法消除動物之間的個體差異，而利用微透析技術(shù)則可以在同一只動物體內(nèi)得到全部數(shù)據(jù)。因此，直接進(jìn)行關(guān)節(jié)腔采樣更能反映治療的真實(shí)情況，而微透析采樣技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)研究的需要，達(dá)到了解關(guān)節(jié)局部藥動學(xué)行為的目的。家兔關(guān)節(jié)腔中微透析探針植入方法的建立及微透

19、析技術(shù)在關(guān)節(jié)腔局部藥動學(xué)研究中的成功應(yīng)用為同類藥物的藥動學(xué)及藥效學(xué)研究提供了借鑒作用。參考文獻(xiàn)1 DELGADO J M,DF,FEUDIS F V,ROTH R H,et al.Dialytrode for long term intracerebral perfusion in awake monkeysJ.Arch Int Pharmacodyn Ther,1972,198(1):9-212 Chang YL,Tsai PL,Chou YC,et al.Simultaneous deteminstion of nicotine and its metabolite,cotinine,in

20、 rat blood and brain tissue using microdialysis coupled with liquid chromatography:pharmacokinetic applicationJ.J Chromatofr A,2005,1088(1-2):1523 Funan C,Zhujun Z,Yingxue Z,et al.Microdialysis sampling and highperformance liquid chromatography with chemiluminescence detection for in-vivo on-line de

21、termination and study of the pharmacokinetics of levodopa in bloodJ,Anal Bioanal Chem,2005,382(1):2114 Tsai PL,Tsai TH.Hepatobiliary excretion of berberineJ.Drug Metab Dispos,2004,32(4):4055 Tsai TH,Wu JW.Regulation of hepatobiliary excretion of sinomenine by P-glycoprotein in Sprague-Dawley ratsJ.Life Sci,2003,72(21):24136 Tomaselli F,Dittrich P,Maier A,et al.Penetration of piperacillin and tazobactam into pneumonic human lung tissue measured by in vivo microdialysisJ.Br J Clin Pharmacol,2003,55(6):6207 Yen-Hsua