谷氨酸系列發(fā)酵實驗

1、谷氨酸發(fā)酵工程系列實驗一、 實驗?zāi)康?、了解發(fā)酵工業(yè)菌種的制備工藝和質(zhì)量控制，為發(fā)酵實驗準(zhǔn)備菌種。2、了解發(fā)酵罐的操作，完成谷氨酸發(fā)酵的全過程操作、3、了解和掌握快速測定還原糖含量的方法。4、了解和掌握快速測定發(fā)酵過程谷氨酸含量的方法5、了解用等電點法從發(fā)酵液中回收谷氨酸的方法二、 實驗原理谷氨酸是由谷氨酸棒桿菌以葡萄糖為原料生產(chǎn)的一種呈味氨基酸，其代謝機(jī)理為：葡萄糖先經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，丙酮酸經(jīng)氧化脫氨基作用生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成酮戊二酸，酮戊二酸再經(jīng)氨基化作用生成谷氨酸。由于谷氨酸棒桿菌為生物素缺陷型突變株，因此在發(fā)酵過程中要控制生物素亞適量。三、 實驗材料、儀器

2、與試劑1、材料：谷氨酸棒桿菌、發(fā)酵培養(yǎng)基、谷氨酸發(fā)酵液不同發(fā)酵時間所取的樣品等。2、儀器：三角瓶、燒杯、量筒、玻棒、pH試紙、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、培養(yǎng)箱、顯微鏡、發(fā)酵罐及控制系統(tǒng)、蒸汽發(fā)生器、空氣壓縮機(jī)、補(bǔ)料瓶、補(bǔ)料針、硅膠管、滴定管、滴定架、電爐、容量瓶、高速離心機(jī)、分光光度計、恒溫水浴鍋、移液器及槍頭、無極調(diào)速攪拌機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、冰箱等3、試劑：無水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取液、NaCl、NaOH、HCl、KNO3、去離子水、葡萄糖、尿素、消泡劑、硫酸銅、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氫化鉀、鹽酸、L-谷氨酸分析純、茚三酮、丙酮、酒精等。四、 實驗步驟

3、1、培養(yǎng)基的制備（1）斜面培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCl0.5%；瓊脂2%（pH7.0）（2）一級培養(yǎng)基：蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCl1%（pH7.2）（3）二級培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%；尿素0.34%；K2HPO4·3H2O0.16%；MgSO4·7H2O；FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各0.0002%（pH7.0）各培養(yǎng)基分裝到到三角瓶，用鋁箔紙封口，高壓滅菌。2、菌種制備斜面菌種接種100mL一級種子培養(yǎng)基后置于控溫?fù)u床200r/min，震蕩培養(yǎng)12h，溫度為32。取10mL一級種子接種到100mL二級

4、種子培養(yǎng)基中，置于控溫?fù)u床200 r/min，震蕩培養(yǎng)78h，溫度為3334.3、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備及滅菌配制好5L發(fā)酵培養(yǎng)基。配方：葡萄糖13%、硫酸鎂0.06%、磷酸氫二鉀0.1%、氫氧化鉀0.04%、糖蜜0.3%、硫酸亞鐵及硫酸錳各0.0002%。配置400ml40%尿素及400ml消泡劑需滅菌。4、接種清洗好發(fā)酵罐，對發(fā)酵罐進(jìn)行空消，加入5L的發(fā)酵培養(yǎng)基，對發(fā)酵罐進(jìn)行實消，在接種槽中加好酒精并點燃，把二級種子培養(yǎng)基從接種口倒進(jìn)發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。5、發(fā)酵過程控制（1）溫度：012h溫度為3032，發(fā)酵12h后為3436.（2）pH：當(dāng)pH值降到7時，需加氮源。pH試紙的測定（3）通風(fēng)量進(jìn)氣

5、指針為0.46、試劑配置（1）斐林試劑：甲液：五水硫酸銅3.5g，亞甲基藍(lán)0.005g，用水溶解并稀釋至100ml；乙液：酒石酸鉀鈉11.7g，氫氧化鈉12.64g，亞鐵氫化鉀0.94g，用水溶解并稀釋至100ml；0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：取葡萄糖1g，用少量水溶解，轉(zhuǎn)至1000ml容量瓶中，加入5ml鹽酸，用水稀釋定容至1000ml，搖勻；7、斐林試劑的標(biāo)定甲、乙液各5ml，置于100ml錐形瓶中，加水10ml，從滴定管中預(yù)先加入約20ml0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，搖勻。于電爐上加熱至沸騰，在沸騰的狀態(tài)下以每秒一滴的速度加入0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，至藍(lán)色剛好消失為終點。記錄前后總共消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡

6、萄糖溶液的總體積。同法平行操作3次，取接近兩次體積的平均值為V0。8、還原糖的滴定甲、乙液各5ml，置于100ml錐形瓶中，加入0.1mlV1發(fā)酵液，搖勻后于電爐上加熱至沸騰，在沸騰狀態(tài)下以每秒一滴的速度加入0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，至藍(lán)色剛好消失為終點。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的總體積V2.計算公式：還原糖（以葡萄糖計g/100ml）=（V0- V2）×C×1/ V1×1009、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備：L-谷氨酸純品梯度稀釋溶液：分別稱取0.05-0.5g分析純L-谷氨酸,并分別溶解到100ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH5.5-6。（2）茚三酮試劑的制備

7、：稱取0.5g茚三酮溶于100ml丙酮。（3）pH調(diào)節(jié)試劑的制備：2moL/L氫氧化鈉溶液（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液OD569值的測定：取20支試管，分別加入3ml配制好的（0. 5-5）g/100ml的L-谷氨酸純品溶液各兩管，每支試管分別沿試管壁加入茚三酮試劑0.5ml，搖勻，迅速置于80水浴，3min后，冰浴3min，將分光光度計波長調(diào)至569nm處，以蒸餾水為空白對照，用1cm玻璃比色皿比色，測出OD569值。以O(shè)D569值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。10、發(fā)酵液谷氨酸含量測定谷氨酸發(fā)酵液11400r/min，離心5min，取上清，蒸餾水稀釋100倍，調(diào)節(jié)pH值5.5-6，取3ml預(yù)處理好的發(fā)酵液加入

8、15mm×150mm試管，調(diào)整pH值5.5左右，沿試管壁加入0.5ml茚三酮試劑，混勻，迅速置于80水浴，3min后，冰浴3min，將分光光度計波長調(diào)至569nm處，以100稀釋的空白發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，用1cm玻璃比色皿比色，測出OD569值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)L-谷氨酸濃度。五、實驗結(jié)果及分析表一 谷氨酸發(fā)酵實驗記錄表時間/h04812141618202224262830溫度31.831.931.831.831.031.931.831.931.931.931.935.836.0pH5.56.06.87.07.07.06.86.87.06.86.56.85.5DO值214.91

9、29.8251.3253.9282.1265.6263.8224.0219.1231.9225.5258281.5通風(fēng)量4.84.85.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0OD6000.2880.3240.3440.2930.2960.3160.7050.8100.9041.0040.630.7220.732還原糖含量12.6510.2311.6915.4211.011.812.611.611.312.2113.013.7谷氨酸含量時間/h323436384042444648溫度35.835.835.736.035.735.835.73635.7pH7.07.07.0

10、6.57.06.77.06.56.7DO值270.4278.9277.2278.2295.3286.6273.4285.2266.8通風(fēng)量5.05.05.05.05.05.05.05.05.0OD6000.7390.7280.7800.8900.6020.6080.990.991.25還原糖含量14.4511.7012.0710.912.611.310.112.011.8谷氨酸含量由上面的記錄表中我們可以看到126h我們都是保持3132度的溫度進(jìn)行發(fā)酵，期間，在1618h的時候OD值發(fā)生了一次飛躍，從0.316跳到0.705，但是溶氧值、PH值和還原糖的含量都沒有發(fā)生明顯的變化，而在2426h

11、的時候，OD值發(fā)生驟降，但是其他參數(shù)的變化不大，這兩個轉(zhuǎn)折點分別表示著谷氨酸棒狀桿菌進(jìn)入生長期和衰老期，但是由于谷氨酸棒狀桿菌的數(shù)量不是很多，因此除了OD值變化較大之外，其他參數(shù)變化不大。此次實驗的結(jié)果并不理想，以下是在網(wǎng)上查到的關(guān)于谷氨酸發(fā)酵過程的資料：在發(fā)酵過程中，氧、溫度、pH和磷酸鹽等的調(diào)節(jié)和控制如下：氧。谷氨酸產(chǎn)生菌是好氧菌，通風(fēng)和攪拌不僅會影響菌種對氮源和碳源的利用率，而且會影響發(fā)酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發(fā)酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時產(chǎn)生的是乳酸或琥珀酸。溫度。菌種生長的最適溫度為3032 。當(dāng)菌體生長到穩(wěn)定期，適當(dāng)提高溫度有利于產(chǎn)酸，因此，在發(fā)酵后期，可將溫度提高到3437 。pH。谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵的最適pH在7.08.0。但在發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的利用，代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)液的pH會不斷變化。如隨著氮源的利用，放出氨，pH會上升；當(dāng)糖被利用生成有機(jī)酸時，pH會下降。其中谷氨酸棒狀桿菌在pH呈酸性時生成乙酰谷胺酰胺。根據(jù)資料的說明和我們的數(shù)據(jù)記錄表發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致實驗失敗的原因可能與溫