功能基因的克隆及生物信息學(xué)分析

1、功能基因的克隆及其生物信息學(xué)分析摘要：隨著多種生物全基因組序列的獲得，基因組研究正從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics）轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)(functional genomics)的整體研究。功能基因組學(xué)利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究獲得的大量數(shù)據(jù)與信息評(píng)價(jià)基因功能(包括生化功能、細(xì)胞功能、發(fā)育功能、適應(yīng)功能等)，其主要手段結(jié)合了高通量的大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)方法、統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)1，它代表了基因分析的新階段，已成為21世紀(jì)國(guó)際生命科學(xué)研究的前沿。功能基因組學(xué)是利用基因組測(cè)序獲得的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段， 通過(guò)在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白的

2、研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，是在基因組靜態(tài)的組成序列基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入對(duì)基因組動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究 2。如何研究功能基因，也成為我們面臨的一個(gè)課題，本文就克隆和生物信息學(xué)分析在研究功能基因方面的應(yīng)用做一個(gè)簡(jiǎn)要的闡述。關(guān)鍵詞：功能基因、克隆、生物信息學(xué)分析。1. 功能基因的克隆1.1 圖位克隆方法圖位克隆又稱定位克隆，它是根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上確切位置，尋找與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，篩選BCA克隆，通過(guò)染色體步移法逐步逼近目的基因區(qū)域，根據(jù)測(cè)序結(jié)果或用BAC、YAC克隆篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)尋找候選基因，得到候選基因后再確定目標(biāo)基因。優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需掌握基因產(chǎn)物的任何信息，從突變體開(kāi)始，逐步找到基

3、因，最后證實(shí)該基因就是造成突變的原因。通過(guò)圖位克隆許多控制質(zhì)量性狀的單基因得以克隆，最近也有報(bào)道某些控制數(shù)量性狀的主效基因（控制蕃茄果實(shí)大小的基因克隆3、控制水稻成熟后稻谷脫落基因克隆4以及小麥 VRN2 基因克隆5等）也通過(guò)圖位克隆法獲得。1.2 同源序列克隆目的基因首先根據(jù)已知的基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，在已知材料中擴(kuò)增到該片段，并經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證，利用放射性同位素標(biāo)記或其他非同位素標(biāo)記該P(yáng)CR片段作為探針，與待研究材料的cDNA文庫(kù)雜交，就可以獲得該基因cDNA克隆，利用克隆進(jìn)一步篩選基因組文庫(kù)，挑選陽(yáng)性克隆，亞克隆并測(cè)序，從中就可以篩選到該基因的完整序列。1.3結(jié)合連鎖和連鎖不平衡的分析方

4、法結(jié)合連鎖和連鎖不平衡的分析方法是未知基因克隆研究領(lǐng)域發(fā)展的新方向6。(Linkage disequilibrium, LD)。 與連鎖分析不同, 連鎖不平衡分析可以利用自然群體中歷史發(fā)生的重組事件。歷史上發(fā)生的重組使連鎖的標(biāo)記漸漸分布到不同的同源染色體上, 這樣就只有相隔很近的標(biāo)記才能不被重組掉, 從而形成大小不同的單倍型片段(Haplotype block)。這樣經(jīng)過(guò)很多世代的重組, 只有相隔很近的基因, 才能仍處在相同的原始單倍型片段上, 基因間的連鎖不平衡才能依然存在。所以基于連鎖不平衡分析, 可以實(shí)現(xiàn)目的基因的精細(xì)定位。林木大多為自由授粉的異交物種, 所以連鎖不平衡程度很低, 林木基

5、因組中的 LD可能會(huì)僅局限于非常小的區(qū)域, 這就為目的基因的精細(xì)定位提供了可能, 結(jié)合 SNP 檢測(cè)技術(shù), 科學(xué)家甚至可以將效應(yīng)位點(diǎn)直接與單個(gè)的核苷酸突變關(guān)聯(lián)起來(lái), 進(jìn)行數(shù)量性狀寡核苷酸(Quantitative trait nucleotide, QTN)作圖。當(dāng)然除了相隔很近的基因, 某些相隔較遠(yuǎn)的基因, 由于受相同的選擇壓力, 也可能產(chǎn)生連鎖不平衡。但通過(guò)家系分析, 首先可以進(jìn)行目的基因的粗略定位, 將目的基因首先限定到一個(gè)較小的區(qū)域, 只針對(duì)該區(qū)域內(nèi)的 SNP 進(jìn)行相關(guān)性分析, 從而消除非由連鎖引起的連鎖不平衡干擾。隨著林木全基因組測(cè)序的發(fā)展, 連鎖圖譜與 LD 分析相結(jié)合的方法將是在

6、林木中實(shí)現(xiàn)未知基因克隆的最有效的方法6。1.4電子克隆近年來(lái)又興起一種新的基因克隆方法-電子克隆，它是近年來(lái)伴隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù)，借助電子計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力，通過(guò)EST或基因組的序列組裝和拼接,利用 RT-PCR的方法快速獲得功能基因,具有投入低、速度快、技術(shù)要求低和針對(duì)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)7。1.4.1利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息首先選擇感興趣的水稻 , EST作為查詢探針，搜索水稻dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)，找到部分重疊的EST進(jìn)行拼接，然后再以拼接好的EST重疊群為新的查詢探針，繼續(xù)搜索 dbEST庫(kù),直到?jīng)]有新的EST可供拼接為止，最后

7、根據(jù)拼接好的完整序列設(shè)計(jì)PCR引物，通過(guò)RT-PCR的方法獲得目的cDNA克隆并進(jìn)行序列測(cè)定驗(yàn)證7。圖1為利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息克隆水稻功能基因的試驗(yàn)流程。圖1 利用水稻 EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行電子克隆的策略1.4.2利用基因組信息利用基因組信息資料進(jìn)行電子克隆的最大優(yōu)點(diǎn)就是基因的克隆不受作物發(fā)育時(shí)期或特殊環(huán)境條件的限制:可以用來(lái)源于任何時(shí)期或組織的水稻和其他物種的EST或全長(zhǎng)cDNA序列作為信息探針?biāo)阉魑挥贕enBank或者我國(guó)華大公布的水稻基因組序列: 隨后根據(jù)內(nèi)含子的規(guī)則通過(guò)人工拼接或相應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè): 可以得到該基因完整的開(kāi)放讀碼框,根據(jù)拼接的序列結(jié)果設(shè)計(jì)PCR引物: 進(jìn)一步采取RT-PC

8、R的方法獲得目的基因的cDNA克隆并進(jìn)行序列測(cè)定7。具體實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖22 生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)(bioinformatics)是在生命科學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和數(shù)學(xué)的基礎(chǔ) 上逐步發(fā)展而形成的一門(mén)新興交叉學(xué)科，是為理解各種數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義，運(yùn)用數(shù)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)手段進(jìn)行生物信息的收集、加工、存儲(chǔ)、 傳播、分析與解析的科學(xué)8-10。由于歷史原因，有的研究者也使用計(jì)算生物學(xué)(computational biology)或計(jì)算分子生物學(xué)(computational molecular biology) 等不同的術(shù)語(yǔ)。在后基因組時(shí)代，生物信息學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要可分為兩個(gè)重要組成部分：基因組信息學(xué)和蛋白質(zhì)組信息學(xué)

9、11。后基因組時(shí)代，除了繼續(xù)序列和結(jié)構(gòu)分析外，更多的研究力量則投入到功能分析，也就是分析研究遺傳型到表型的過(guò)程12。2.1 基因序列同源性比對(duì)及其應(yīng)用基因序列同源性的比對(duì)，對(duì)于分析基因組DNA序列以及完成新基因的染色體定位也是極為便捷的。將確定的新基因的編碼基因序列作為參照，對(duì)于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中高通量基因序列(htgs)數(shù)據(jù)庫(kù)中基因組DNA序列進(jìn)行同源性對(duì)比，當(dāng)發(fā)現(xiàn)與新基因的cDNA序列完全同源的基因組DNA序列時(shí)，根據(jù)Chambon原則，內(nèi)含子(intron)的序列總是以GT開(kāi)始，以AG結(jié)束，就可以確定該基因的基因組DNA序列的結(jié)構(gòu)，及外顯子(exon)-內(nèi)含子序列結(jié)構(gòu)。因?yàn)樵趆tgs

10、數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的基因組DNA序列，其染色體的來(lái)源是十分清楚的，因此就很容易、很方便地將該基因組進(jìn)行染色體的定位，而不再需要進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)的常規(guī)的基因染色體定位技術(shù)?？梢?jiàn)基因的生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)于基因組DNA序列的確定和在染色體上的定位是多么重要。遲光紅等在香蕉中獲得一個(gè)檸檬酸合酶基因的cDNA序列。用NCBI Blastx分析，得出它具有植物檸檬酸合酶基因的特征結(jié)構(gòu)域，并與其他植物中檸檬酸合酶基因的同源性較高，進(jìn)一步證明了該cD NA編碼香蕉中的檸檬酸合酶13。李學(xué)農(nóng)等通過(guò)Internet查詢美國(guó)國(guó)家生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)采用BLAST，依據(jù)Genecard和Ense- mb

11、l獲得將MGC39325基因定位于人染色體8q1214。2.2 結(jié)構(gòu)分析與功能預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)分析的研究重點(diǎn)在于研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。利用分子模擬技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)圖形技術(shù)可以更形象、更直觀地研究蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的更清晰的表述和研究對(duì)揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、總結(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的規(guī)律、預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)肽鏈折疊和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等，都是有力的幫助和促進(jìn)。同時(shí)，也可以對(duì)已經(jīng)被測(cè)定的生物大分子的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯示和編輯操作。分子模型的建立為下一步進(jìn)行的分子模擬以及了解結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是利用已知的一級(jí)，二級(jí)序列來(lái)構(gòu)建蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)模型， 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)需要具體問(wèn)題具體

12、分析，在不同的已知條件下對(duì)于不同的蛋白質(zhì)采取不同的策略。楊波等以 LRP16 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為目標(biāo)序列，在人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索開(kāi)放閱讀框（ORF），利用計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)預(yù)測(cè)LRP16蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用結(jié)構(gòu)域搜索 LRP16 編碼蛋白的同源或相似結(jié)構(gòu)蛋白15。2.3 蛋白質(zhì)的同源性檢索及系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)分析將推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列登錄到 NCBI網(wǎng)站( http：/wwwncbinlmn ihgov /)上，用BL AST程序進(jìn)行序列的同源性檢索16-18。王安娜等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆的C4H蛋白質(zhì)與綠豆、馬鈴薯、棉、辣椒、橄欖、煙草、律草屬啤酒花等的 C 4 H蛋白質(zhì)有著很顯著的同源性

13、。 在BLA ST p分析的基礎(chǔ)上，選擇與其同源性較高的幾條序列做聚類分析，對(duì) C4H蛋白和其他C4H蛋白的同源性做進(jìn)一步分析。在 DNAMA N 6.0 的 Treeview顯示的結(jié)果。結(jié)果表明大豆C4 H和綠豆的C4H親緣關(guān)系最近，同源性達(dá) 95，來(lái)自于同一個(gè)分枝；其次是紫苜蓿、紅車(chē)軸草、鷹嘴豆、豌豆,來(lái)自同個(gè)次分枝19。參考文獻(xiàn)1 黎裕、王天宇、賈繼增. 植物功能基因組學(xué)的發(fā)展現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì). 生物技術(shù)通報(bào) 2000；6-102 劉斌.生命科技的前沿領(lǐng)域，HIGH TECHNOLOGY AND INDUSTRIALIZATION AUGUST 2006；48-54 3 Frary A,

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