生物學(xué)中的組織培養(yǎng)

1、生物學(xué)中的組織培養(yǎng)一、組織培養(yǎng)(Tissue culture)的含義組織培養(yǎng)，簡(jiǎn)單地說即把來自機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官放于類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中使其存活或/和生長(zhǎng)、增殖。嚴(yán)格地區(qū)分，它又可分為細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture )：指細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)、增殖，但培養(yǎng)中的細(xì)胞不再結(jié)合成組織；組織培養(yǎng)：指組織在體外存活生長(zhǎng)，并保持其結(jié)構(gòu)和/或功能及進(jìn)行分化；器官培養(yǎng)(Organ culture)：指器官的原基、全部或部分器官在體外的存活生長(zhǎng)，并保持其結(jié)構(gòu)和/或功能及進(jìn)行分化。但組織培養(yǎng)一詞又常泛地指各種體外培養(yǎng)。更廣義地說，組織培養(yǎng)可包括人及動(dòng)物的組織培養(yǎng)，植物的組織培養(yǎng)以及病毒培養(yǎng)等。各種不同的組織

2、培養(yǎng)在方法上雖有其不同和特殊要求，但它們又有共同的基本原則和技術(shù)。本文主要從人和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的角度加以介紹。二、組織培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展早在19世紀(jì)末就開始了對(duì)活細(xì)胞的體外觀察與保存工作。1885年Roux 用生理鹽水培養(yǎng)雞的神經(jīng)板，發(fā)現(xiàn)它可在鹽水中生活一段時(shí)間。 1887年 Arnold用一種巧妙的方法培養(yǎng)白細(xì)胞，他將赤楊木的髓質(zhì)薄片浸于蛙的體液中，然后種植到蛙的皮下，當(dāng)將髓片取出置于鹽水中時(shí)，可觀察到白細(xì)胞從髓片上向鹽水內(nèi)移動(dòng)并能較長(zhǎng)時(shí)期保持它的生活力。1903年Jlly分別將皮膚及白細(xì)胞培養(yǎng)于腹水及血清中，細(xì)胞存活可達(dá)一周到一個(gè)月，并看到了細(xì)胞分裂。但真正的組織培養(yǎng)應(yīng)歸功于1907年Ha

3、rrison的努力，他為探討神經(jīng)纖維的真正來源，從蛙胚中分離出一部分神經(jīng)管，培養(yǎng)在一滴蛙的淋巴液中，成功地看到了神經(jīng)纖維的末端不停地進(jìn)行阿米巴運(yùn)動(dòng)，其中一根神經(jīng)纖維在25分鐘之內(nèi)長(zhǎng)到20微米，另一根在50分鐘內(nèi)長(zhǎng)到25微米，最長(zhǎng)的達(dá)到了200微米。這一發(fā)現(xiàn)不僅解決了當(dāng)時(shí)爭(zhēng)論不休的神經(jīng)纖維的起源問題，也是在后來組織培養(yǎng)中懸滴培養(yǎng)法的開始。1912年Carrel發(fā)現(xiàn)雞胚浸出液對(duì)多種細(xì)胞生長(zhǎng)有高度促進(jìn)作用，他將7天雞胚心臟的組織塊培養(yǎng)在血漿和雞胚提取液的混合物中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)出暈后再把它分成兩分進(jìn)行培養(yǎng)，在當(dāng)時(shí)沒有抗菌素，所以細(xì)菌污染是一個(gè)最大的困難，但由于Carrel是一個(gè)有成就的實(shí)驗(yàn)外科學(xué)家，有豐

4、富的無菌操作知識(shí)，所以在他的努力下雞胚細(xì)胞的培養(yǎng)連續(xù)維持了34年之久。雖然由于經(jīng)常加入新鮮的胚胎浸出液而使人懷疑是否帶入了新的細(xì)胞，但他使用的培養(yǎng)液，采用的無菌技術(shù)，以及后來設(shè)計(jì)的培養(yǎng)瓶(卡氏瓶)等都是對(duì)組織培養(yǎng)的重要貢獻(xiàn)。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來的傳代培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。大約與此同時(shí)，在Carrel等人工作的影響下，一些學(xué)者開始了細(xì)胞培養(yǎng)中的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)液的滲透壓，酸堿度等因素的研究。從而設(shè)計(jì)出了能長(zhǎng)期維持動(dòng)物組織、細(xì)胞生存的各種人工培養(yǎng)液，其中1950年Morgan等人經(jīng)過大量研究設(shè)計(jì)的“199”培養(yǎng)液至今仍廣泛用于人及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。1943年Earle用致癌物20-甲基膽蒽處理來源

5、于C3H小鼠的結(jié)締組織培養(yǎng)物，獲得了能回種于小鼠體內(nèi)而生長(zhǎng)成肉瘤的長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞系，定名為L(zhǎng)細(xì)胞系。1951年Gey成功地由人的宮頸癌組織建立了能在體外連續(xù)長(zhǎng)期培養(yǎng)的Hela細(xì)胞系。這些細(xì)胞系至今仍在世界各國廣為應(yīng)用。我國細(xì)胞學(xué)工作者在組織培養(yǎng)方面也有一定貢獻(xiàn)。如早在1953年鮑鑒清就培養(yǎng)了皮膚、睪丸、卵巢、羊膜、腹膜等組織。陳瑞銘(1957年)設(shè)計(jì)了一種擦鏡紙的器官培養(yǎng)法，成功地培養(yǎng)了大鼠的肝、胰、腦、垂體、甲狀腺、腎上腺等器官。何申等(1959年)建立了來源于人體的骨軟骨肉瘤細(xì)胞株。三、組織培養(yǎng)的基本條件1 無菌及滅菌由于要維持細(xì)胞在體外長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)、繁殖，所以在培養(yǎng)過程中的全部用具及操作過

6、程必須保證無菌，一旦有細(xì)菌污染細(xì)胞則不能繼續(xù)存活。因此所用器具應(yīng)首先進(jìn)行嚴(yán)格清洗，然后再進(jìn)行高壓滅菌或干烤滅菌。對(duì)不能用高壓或干烤滅菌的液體可用除菌濾器除菌。過去的操作環(huán)境一般在無菌室(密封，使用前用紫外線殺菌)進(jìn)行。近年多應(yīng)用國產(chǎn)潔凈工作臺(tái)(借助空氣過濾及高速吹風(fēng)除菌)進(jìn)行操作。亦可二者結(jié)合應(yīng)用。2 培養(yǎng)基(medium)人工培養(yǎng)基的成分主要含有各種氨基酸，維生素，糖和無機(jī)鹽等，并使其有與體液相等的滲透壓，同時(shí)加入適量的碳酸氫鈉，以調(diào)節(jié)其酸堿度，使pH維持在7.27.6左右。目前常用的人工培養(yǎng)基種類很多，如：“199”、“RPMI1640”、伊格(Eagle)、費(fèi)歇(Fischer)等等。它

7、們之間的區(qū)別主要在含有氨基酸、維生素等的數(shù)量和種類上有所不同。在應(yīng)用時(shí)可根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞類型及自己的經(jīng)驗(yàn)而選擇。但是，目前無論使用哪種培養(yǎng)基一般都要加入520的動(dòng)物血清，最常用者為初生的小牛血清，其次，馬血清、人血清等亦有應(yīng)用。由于對(duì)血清的成分還不完全清楚，所以它對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的作用機(jī)理也還不十分了解。近來對(duì)無血清培養(yǎng)亦有文獻(xiàn)報(bào)道，但這一問題尚在研究之中。當(dāng)然，理想的人工培養(yǎng)基最好完全模擬體內(nèi)環(huán)境，不過目前尚未達(dá)到。3 培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿液體培養(yǎng)常用長(zhǎng)方形培養(yǎng)瓶，有100ml，30ml， 15ml不等，此外還有扁圓形的卡氏瓶以及適用于微量培養(yǎng)的多孔微量培養(yǎng)板等。在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行開放培養(yǎng)時(shí)多用培養(yǎng)

8、皿，同時(shí)它也被用于半固體培養(yǎng)。國內(nèi)所用培養(yǎng)瓶(皿)均采用優(yōu)質(zhì)中性玻璃制成，便于洗涮及反復(fù)應(yīng)用。但國外現(xiàn)已普遍采用塑料制品。4 溫度及二氧化碳用培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，一般放于37恒溫箱中即可，目前國外已普遍將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，在含510的二氧化碳的空氣環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。一定量的二氧化碳有利于酸堿度的維持及細(xì)胞生長(zhǎng)。二氧化碳培養(yǎng)需要放在二氧化碳培養(yǎng)箱中。二氧化碳培養(yǎng)箱，它除可維持37恒溫之外，還可維持一定的二氧化碳濃度，雖然近年來國內(nèi)已有產(chǎn)品，但價(jià)格仍較昂貴，不易推廣使用。用真空干燥器充以含510二氧化碳的空氣來代替二氧化碳培養(yǎng)箱可以達(dá)到同樣目的，這種方法目前已為國內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室所采用。四、組織培養(yǎng)方法的

9、基本類型1 液體培養(yǎng)(Liquidculture)使細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，目前應(yīng)用最廣。以細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中的存在方式區(qū)分，它又分為兩種：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)(monolayer culture)：培養(yǎng)的細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶(皿)底面的壁上，長(zhǎng)成一層單層細(xì)胞的薄片。懸浮培養(yǎng)(suspension culture)：培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液中，不貼于瓶壁。亦有的培養(yǎng)物一部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，另一部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。以培養(yǎng)的目的區(qū)分，用液體培養(yǎng)法(包括單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng))又有以下幾種：原代培養(yǎng)(Primary culture)：即將直接取自機(jī)體的組織塊或細(xì)胞如：血細(xì)胞、胸腔或腹腔的游離細(xì)胞或?qū)⒔M織取出后在體外制成

10、的分散細(xì)胞放入培養(yǎng)瓶(皿)中進(jìn)行培養(yǎng)，在進(jìn)行傳代之前稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞密度增加，如不傳代一般大部分細(xì)胞在短期內(nèi)死亡，存活的細(xì)胞亦不能進(jìn)行正常增殖。原代培養(yǎng)可作為建立細(xì)胞系或細(xì)胞株的開始，亦可進(jìn)行短期的實(shí)驗(yàn)研究。傳代培養(yǎng)(Subculture)：把原代培養(yǎng)的細(xì)胞分開接種于新的培養(yǎng)瓶(皿)中，稱為“傳代”(Passage)，每分開接種一次為一代。一般所說的培養(yǎng)細(xì)胞的“代數(shù)”即由此計(jì)算而來?？寺∨囵B(yǎng)(Clone culture)：從原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞中分離出單個(gè)細(xì)胞并使其增殖或使單個(gè)細(xì)胞增殖后再進(jìn)行分離，稱為克隆培養(yǎng)。細(xì)胞系(Cell line)和細(xì)胞株(Cell stra

11、in)的培養(yǎng)：把原代培養(yǎng)的細(xì)胞連續(xù)傳代即稱為細(xì)胞系。從原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇出具有特殊性質(zhì)或特征的細(xì)胞，使其克隆化，并在以后的連續(xù)培養(yǎng)中保持這種特殊性質(zhì)或特征，即稱為細(xì)胞株。2 半固體培養(yǎng)(Semisolid culture)在培養(yǎng)液中加入0.3左右的瓊脂，使培養(yǎng)基成為半固體的膠凍狀態(tài)，細(xì)胞在其中增殖而不脫離原位。從而由一個(gè)細(xì)胞增殖而來的細(xì)胞聚集在一起，形成一個(gè)集落。它可用于對(duì)增殖細(xì)胞的計(jì)數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞克隆的選擇以及對(duì)正常細(xì)胞惡變鑒定的指標(biāo)。同時(shí)更廣泛地用于對(duì)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)。五、組織培養(yǎng)在生物學(xué)研究中的地位和應(yīng)用我們知道生物學(xué)的研究對(duì)象是有生命的生物，而那些構(gòu)成生命物質(zhì)的蛋白質(zhì)、核酸、脂類

12、、糖類及其它分子都不能單獨(dú)地完成生命過程，只有當(dāng)這些分子按一定方式構(gòu)成細(xì)胞之后才能表現(xiàn)出生命現(xiàn)象。因此，細(xì)胞不僅是構(gòu)成生物機(jī)體的基本組成單位，也是研究一切生命現(xiàn)象和本質(zhì)的基本材料。在組織培養(yǎng)技術(shù)未完善之前，用于生物學(xué)研究的細(xì)胞主要來自整體動(dòng)物，其缺點(diǎn)在于對(duì)細(xì)胞本身只能進(jìn)行死后觀察，同一組織中的不同細(xì)胞不易分開，并且常夾雜著其它組織成分，以及實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，材料來源不便等。而用體外培養(yǎng)的細(xì)胞則可在細(xì)胞水平直接觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等動(dòng)態(tài)過程，從而研究它們?cè)诟鞣N因素作用下的變化規(guī)律。同時(shí)它又可將實(shí)驗(yàn)條件直接作用于細(xì)胞，而不受體內(nèi)神經(jīng)、體液等因素的干擾。特別是對(duì)不能直接用人體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的研究，可將所要研究的人體細(xì)胞取下來通過組織培養(yǎng)進(jìn)行研究。組織培養(yǎng)不僅是細(xì)胞學(xué)研究中的一種重要方法，也是生物學(xué)許多學(xué)科研究中的一項(xiàng)基本條件和技術(shù)。如：在腫瘤學(xué)研究中，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)可以研究引起細(xì)胞癌變的因素和原理，研究殺滅癌細(xì)胞的藥物；在免疫學(xué)中可用培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)各種病毒疫苗及抗體等；在遺傳學(xué)研究中首先要通過細(xì)胞培養(yǎng)才能制出供進(jìn)行分析的染色體標(biāo)本。特別是在一些新型的生物學(xué)科的研究中，如：細(xì)胞工程研究中的細(xì)胞融合，細(xì)胞的核移植以及基因工程研究中的基因移植等都需要利用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行?？梢灶A(yù)料這些研究成果將有助于解決諸如像腫瘤的發(fā)生，遺傳性疾病