聚谷氨酸高效工程菌株的構(gòu)建和代謝調(diào)控

1、同行評議組別農(nóng)業(yè)微生物學(xué)項(xiàng)目編號(hào)Y305236浙江省自然科學(xué)基金申 請 書申報(bào)類別:一般項(xiàng)目項(xiàng)目名稱:-聚谷氨酸高效工程菌株的構(gòu)建和代謝調(diào)控申 請 者:阮紅電 話托單位:浙江大學(xué)城市學(xué)院通信地址:杭州市湖州街50號(hào)浙江大學(xué)城市學(xué)院生命科學(xué)分院郵政編碼:310015E-mail :ruanhong申報(bào)日期:2005-5-25浙江省自然科學(xué)基金委員會(huì)二OO五年制基本信息申請者信息姓 名阮紅性別女出生日期1968年05月15日最終學(xué)位博士獲學(xué)位年份2000職稱副教授主要研究領(lǐng)域微生物基因代謝調(diào)控機(jī)理研究E-mailruanhong電 人網(wǎng)頁

2、 依托單位浙江大學(xué)城市學(xué)院證件類型身份證證件號(hào)請者是否近三年調(diào)入在浙單位工作是調(diào)入時(shí)間2004年08月申請者曾主持的浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目編號(hào): 申請者正在主持的國家和省部資助經(jīng)費(fèi)在20萬元及以上的研究項(xiàng)目名稱、來源和研究期限: 項(xiàng)目基本信息項(xiàng)目名稱-聚谷氨酸高效工程菌株的構(gòu)建和代謝調(diào)控申報(bào)類別一般項(xiàng)目研究屬性前瞻性應(yīng)用基礎(chǔ)研究同行評議組別農(nóng)業(yè)科學(xué)及生物技術(shù)/農(nóng)業(yè)微生物學(xué)依托基地名稱浙江省細(xì)胞與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-浙江大學(xué)預(yù)計(jì)研究年限2006年01月2007年12月總經(jīng)費(fèi)預(yù)算10.0萬元申請經(jīng)費(fèi)10.0萬元項(xiàng)目研究目標(biāo)、內(nèi)容和意義簡介(限400字)本

3、項(xiàng)目圍繞2005年浙江省自然科學(xué)基金申請指南第(12)項(xiàng)農(nóng)業(yè)資源產(chǎn)業(yè)生物技術(shù)研究方向中提及“食品、功能與藥用物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)所需的高效工程菌”重點(diǎn)問題立項(xiàng)展開研究，意在采用基因過量表達(dá)和基因整合手段，將-聚谷氨酸生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵合成酶復(fù)合體基因pgsBCA導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌優(yōu)質(zhì)的谷氨酸高產(chǎn)菌種中，構(gòu)建-聚谷氨酸高效工程菌株，以期實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌中的-聚谷氨酸高效表達(dá)，尋找基因工程技術(shù)對-聚谷氨酸合成的有效調(diào)整作用。令人鼓舞的是，-聚谷氨酸高效工程菌株構(gòu)建研究意向，還得到了省內(nèi)氨基酸生產(chǎn)行業(yè)知名企業(yè)的高度關(guān)注，廠方予以大力支持并配合我們展開科研工作，并提供我們高谷氨酸產(chǎn)量的谷氨酸棒桿菌優(yōu)質(zhì)菌種協(xié)助進(jìn)行

4、科技攻關(guān)。該項(xiàng)目啟動(dòng)將是省內(nèi)氨基酸生產(chǎn)領(lǐng)域的一個(gè)新的亮點(diǎn)，必將為省內(nèi)氨基酸企業(yè)實(shí)現(xiàn)-聚谷氨酸發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化奠定重要基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。關(guān)鍵詞（不超過4個(gè)）-聚谷氨酸高效工程菌株;pgsBCA;谷氨酸棒桿菌同行評議分組說明微生物生理與生物化學(xué) 重點(diǎn)資助方向農(nóng)業(yè)資源產(chǎn)業(yè)生物技術(shù)研究項(xiàng)目組主要成員編號(hào)姓名出生日期性別職稱學(xué)位單位名稱電話項(xiàng)目分工每年工作時(shí)間（月）（(月)1阮紅1968年05月15日女副教授博士浙江大學(xué)城市學(xué)責(zé)人72范立梅1965.05.05女副教授碩士浙江大學(xué)城市學(xué)因表達(dá)和整合63蔣立娣1968.07.24女實(shí)

5、驗(yàn)員學(xué)士浙江大學(xué)城市學(xué)酵產(chǎn)物分析64周鵬1978.03.21男碩士生學(xué)士浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)因表達(dá)和調(diào)控105李永亮1979.12.11男碩士生學(xué)士浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)酵產(chǎn)物分析106 7 總?cè)藬?shù)高級(jí)中級(jí)初級(jí)博士后博士生碩士生參加單位數(shù)52010022說明：1.個(gè)人介紹部分申請者必須填寫，其他人員可以不填寫；2.高級(jí)、中級(jí)、初級(jí)、博士后、博士生、碩士生及參加單位數(shù)由申請者負(fù)責(zé)填報(bào)，總?cè)藬?shù)自動(dòng)生成；3.第一人必須是申請者，信息從前面自動(dòng)讀入，但每年工作時(shí)間必須手工錄入。個(gè)人介紹：阮紅：女，1968年出生，博士，

6、副教授，碩士生導(dǎo)師。1991年山東大學(xué)微生物學(xué)專業(yè)本科畢業(yè)，1994年浙江大學(xué)植物病理學(xué)生物技術(shù)專業(yè)碩士研究生畢業(yè)后留校任教。2001年浙江大學(xué)在職博士研究生畢業(yè)。攻讀博士學(xué)位期間，獲德國政府DAAD獎(jiǎng)學(xué)金“博士生聯(lián)合培養(yǎng)計(jì)劃”資助，赴德國Ulm大學(xué)進(jìn)行博士論文研究工作。2002年赴美國加州大學(xué)圣地亞哥分校進(jìn)修。2004年8月調(diào)入浙江大學(xué)城市學(xué)院工作， 任生物技術(shù)系執(zhí)行主任。曾主持國家教育部留學(xué)回國人員啟動(dòng)基金項(xiàng)目，先后參加國家自然科學(xué)基金、國家自然科學(xué)青年基金及國家863計(jì)劃資助項(xiàng)目的研究工作?，F(xiàn)在主持城市學(xué)院人才基金項(xiàng)目“谷氨酸棒桿菌-聚谷氨酸酶復(fù)合體pgsBCA基因的克隆”。多年來，曾在

7、國際學(xué)術(shù)刊物J Biotechnology和中國科學(xué)等國內(nèi)學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文18篇，其中被SCI收錄3篇，12篇為第一作者。學(xué)位獲得：1987-1991：山東大學(xué)微生物學(xué)系，微生物學(xué)專業(yè)學(xué)士學(xué)位。1991-1994：浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，植病專業(yè)生物技術(shù)方向碩士學(xué)位。1996-2001：浙江大學(xué)生物化工專業(yè)生物工程方向博士學(xué)位。在職就讀浙江大學(xué)博士期間，于1999年9月至2000年12月，獲德國政府DAAD獎(jiǎng)學(xué)金“博士生聯(lián)合培養(yǎng)計(jì)劃”資助，赴德國Ulm大學(xué)微生物與生物技術(shù)系從事谷氨酸棒桿菌乙酸代謝調(diào)控機(jī)制的博士論文研究。主持科研項(xiàng)目：2002,12 2004,12主持國家教育部留學(xué)回國人員啟

8、動(dòng)基金項(xiàng)目-谷氨酸棒狀桿菌碳分解代謝調(diào)控蛋白基因ccpA克隆及其代謝調(diào)控機(jī)制研究（項(xiàng)目編號(hào)：108201-G50229，資助經(jīng)額為三萬元）；2004，8 - 2006，8 主持城市學(xué)院人才基金項(xiàng)目-谷氨酸棒桿菌-聚谷氨酸酶復(fù)合體pgsBCA基因的克?。ㄙY助經(jīng)額為六萬元）主要科研論著： 1.RUAN Hong, Gestmeir R, Schnick S, Eikmanns B. The amrG1 gene is involved in the activation of acetate in Corynebacterium glutamicum. The Science in China S

9、er.C Life Science, 2005,48(2):97-105 （SCI收錄，通訊作者） 2.阮紅, Gestmeir R, Schnick S, Eikmanns B. amrG1基因在谷氨酸棒桿菌乙酸活化中的作用 中國科學(xué)C輯, 2004, 34(3):223-231（SCI收錄，通訊作者）3. 阮紅, 宣日榮 谷氨酸棒狀桿菌在乙酸代謝PTA, AK, ICL and MS酶活測定。 enzymes involved in acetate metabolism of Corynebacterium glutamicum. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版) 2003,29(5):5

10、29-533. 4.Gestmeir R, Wendisch V F, Schnicke S, Ruan H, Farwick M, Reinscheid D, Eikmanns B. Acetate metabolism and its regulation in Corynebacterium glutamicum. J Biotechnology, 2003, 104: 99-122 （SCI收錄） 5.阮紅, Eikmanns Bernhard 轉(zhuǎn)座子挽救法對轉(zhuǎn)座子突變菌株中插入位點(diǎn)的定位分析。微生物學(xué)報(bào) 2002, 42(3): 326-3306. 阮紅, Eikmanns Bern

11、hard 谷氨酸棒桿菌基因缺失菌株的定點(diǎn)構(gòu)建。微生物學(xué)報(bào)2002, 42(4)：80-867. 阮紅, Gestmeir Robert, Eikmanns Bernhard 谷氨酸棒狀桿菌在乙酸鹽和葡萄糖基質(zhì)上的藍(lán)白生長篩選. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版) 2002, 28(2): 141-1468. 阮紅, 呂志良 女貞子多糖免疫調(diào)節(jié)作用研究。中國中藥雜志1999, 24（11）：691-6939.許學(xué)偉, 吳敏, 阮紅, 黃偉達(dá), 迪麗拜爾·托乎提 一個(gè)新的Br蛋白基因部分序列測定及分析. 遺傳, 2004, 26(3): 343-348。10.許學(xué)偉, 吳敏, 阮紅, 洪吉

12、, 黃偉達(dá) 嗜鹽古生菌AJ4中BR蛋白基因部分片段和16srRNA基因序列研究。中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2004, 20(1):55-60 申請經(jīng)費(fèi)預(yù)算 10.0 萬元 計(jì)劃開支項(xiàng)目名稱計(jì)算根據(jù)及理由金額（萬元）1信息費(fèi)文獻(xiàn)檢索,資料復(fù)印,版面費(fèi)0.22專題學(xué)術(shù)活動(dòng)費(fèi)參加學(xué)術(shù)會(huì)議和科研交流0.43儀器和設(shè)備購置費(fèi)試劑/藥品購置；玻璃器皿和實(shí)驗(yàn)室易耗品7.04能源材料費(fèi)材料購置,實(shí)驗(yàn)室維持0.55計(jì)劃管理費(fèi)按學(xué)校規(guī)定0.46人員費(fèi)課題組成員勞務(wù)費(fèi)1.5注：開支范圍和標(biāo)準(zhǔn)參見浙江省省級(jí)科技項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)管理暫行辦法（浙財(cái)教字200220號(hào)）。 申請者承諾：我保證： （1）申請書內(nèi)容是真實(shí)的；（2）

13、恪守科學(xué)道德，倫理道德的基本原則；（3）項(xiàng)目組成員知曉申請書內(nèi)容，并自愿參與研究工作；（4）已如實(shí)填報(bào)申請者正在主持的國家和省部資助經(jīng)費(fèi)在20萬元及以上的研究項(xiàng)目名稱、來源和研究期限；（5）如果獲得資助，我將履行項(xiàng)目負(fù)責(zé)人職責(zé)，嚴(yán)格遵守浙江省自然科學(xué)基金委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，切實(shí)保證研究工作時(shí)間，認(rèn)真開展工作，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。若填報(bào)失實(shí)或違反規(guī)定，本人將承擔(dān)全部責(zé)任。 簽字： 日期：項(xiàng)目依托單位承諾:已按規(guī)定對申請人的資格和申請書內(nèi)容進(jìn)行了審核。申請項(xiàng)目如獲資助，我單位保證對計(jì)劃實(shí)施所需要的人力、物力和工作時(shí)間等條件給予保障，嚴(yán)格遵守浙江省自然科學(xué)基金委員會(huì)有關(guān)規(guī)定，督促項(xiàng)目組遵守科學(xué)道德和倫理

14、道德的基本原則，督促項(xiàng)目負(fù)責(zé)人和本單位項(xiàng)目管理部門按照規(guī)定及時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。依托單位公章 日期 .項(xiàng)目：-聚谷氨酸高效工程菌株的構(gòu)建和代謝調(diào)控 性質(zhì)：一般項(xiàng)目1、項(xiàng)目研究意義本項(xiàng)目申請與2005年浙江省自然科學(xué)基金申請指南第(12)項(xiàng)農(nóng)業(yè)資源產(chǎn)業(yè)生物技術(shù)研究方向中提及“食品、功能與藥用物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)所需的高效工程菌”重點(diǎn)問題研究基本吻合。-聚谷氨酸（Poly -glutamic acid，-PGA）是由D-谷氨酸或L-谷氨酸的-羧基與氨基通過酰胺鍵連接聚合而成的均氨基酸化合物，分子量在1×1051×107道爾頓范圍內(nèi)。作為一種生物高分子材料，-PGA具有生物可降解性好、可食、

15、對人體和環(huán)境無毒害的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于食品包裝到一次性餐具使用；-PGA又具有極佳的高吸水性和保濕性, 可增強(qiáng)人體對維生素及礦物質(zhì)的吸收, 用于醫(yī)藥、化妝品、功能保健食品和飲料產(chǎn)業(yè)；-PGA還有抗菌抗氧化等污水處理功效1-4。雖然目前-PGA的市場需求和銷售前景十分可觀，但浙江省乃至國內(nèi)的-PGA規(guī)?；a(chǎn)尚在醞釀中。近來國內(nèi)外主要選用以枯草芽孢桿菌為代表的微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)-PGA。早在1937年由Ivanovics5 首先在Bacillus anthracis的莢膜中發(fā)現(xiàn)了-PGA，此后微生物發(fā)酵法生產(chǎn)-PGA有了一些嘗試性研究。特別是二十世紀(jì)九十年代后，在分離篩選以枯草芽孢桿菌Bacil

16、lus subtilis為代表的-PGA高產(chǎn)菌株方面做了大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)。Kubota從土壤中分離得到的一株Bacillus subtilis F201，該菌株在最佳發(fā)酵生產(chǎn)條件下可以達(dá)到50g/L的最高產(chǎn)量6，該菌株已被Meiji Seika Kaisha公司成功用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)-PGA。Ogawa對 Bacillus subtilis MR 141進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，在30L的發(fā)酵罐中可使-PGA最大產(chǎn)量達(dá)到35g/L7。Yoon對Bacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培養(yǎng)的方法，在2.5升發(fā)酵罐中發(fā)酵35小時(shí)后達(dá)到39g/L的最終產(chǎn)量8。國內(nèi)有研究

17、報(bào)道在適量谷氨酸供給條件下，取得產(chǎn)量達(dá)2030g/L,有望成為生產(chǎn)用株。在篩選優(yōu)質(zhì)菌株的工作基礎(chǔ)上，近年來大量研究工作圍繞-PGA合成酶復(fù)合體的研究展開，特別是在枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中積累了一些科研成果9-16。Ashiuchi 等科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus subtilis中-PGA合成焦點(diǎn)為-PGA合成酶（Poly -glutamate synthetase，簡稱-PGS）復(fù)合體，其中該酶復(fù)合體（PgsBCA）有三種酶組分PgsB、 PgsC 和PgsA構(gòu)成，它們分別由pgsB、pgsA和pgsC三個(gè)酶基因負(fù)責(zé)編碼，開讀框大小為1116bp、1155bp和4

18、50bp。結(jié)合三個(gè)酶組分的疏水氨基酸區(qū)域的研究發(fā)現(xiàn)以及各個(gè)基因突變的組合實(shí)驗(yàn)證實(shí): 酶組分PgsA負(fù)責(zé)-PGA合成后的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；酶組分PgsB為重要的-酰胺連接酶，用于連接形成多聚谷氨酸-PGA， 分析認(rèn)為該酶還具有谷氨酸依賴的ATP水解酶特征；酶組分PgsC是與PgsB相關(guān)的蛋白，功能尚不十分清楚。盡管目前在-PGA的發(fā)酵生產(chǎn)方面取得了較大的進(jìn)展，但在發(fā)酵生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，-PGA合成中關(guān)鍵酶(PgsB, 即-酰胺連接酶)的活性需要依賴于谷氨酸，生產(chǎn)時(shí)需要不時(shí)地給發(fā)酵液添加谷氨酸。因此，高效低成本生產(chǎn)-PGA仍有待于進(jìn)一步研究。如何降低谷氨酸添加成本，不妨考慮利用谷氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌17

19、-21進(jìn)行生產(chǎn)-PGA嘗試。本實(shí)驗(yàn)室已從枯草芽孢桿菌染色體中篩選到負(fù)責(zé)-PGA合成的酶復(fù)合體三種酶組分基因（pgsB、pgsA和pgsC），并在大腸桿菌中分別進(jìn)行了克隆。本項(xiàng)目意在采用基因過量表達(dá)和基因整合技術(shù)，將-聚谷氨酸生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵合成酶復(fù)合體基因pgsBCA導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌優(yōu)質(zhì)的谷氨酸高產(chǎn)菌種中，構(gòu)建-聚谷氨酸高效工程菌株，以期實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌中的-PGA高效表達(dá)，尋找基因工程技術(shù)對-PGA合成的有效調(diào)整作用。令人鼓舞的是，-PGA高效工程菌株構(gòu)建研究意向，還得到了省內(nèi)氨基酸生產(chǎn)行業(yè)知名企業(yè)的高度關(guān)注，廠方予以大力支持并配合我們展開科研工作，并提供我們高谷氨酸產(chǎn)量的谷氨酸棒桿菌優(yōu)質(zhì)菌

20、種協(xié)助進(jìn)行科技攻關(guān)。該項(xiàng)目啟動(dòng)將是省內(nèi)氨基酸生產(chǎn)領(lǐng)域的一個(gè)新的亮點(diǎn)，必將為省內(nèi)氨基酸企業(yè)實(shí)現(xiàn)-PGA發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化奠定重要基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。2、項(xiàng)目研究目標(biāo)及與申請者研究工作長期目標(biāo)的關(guān)系研究目標(biāo)：在谷氨酸棒桿菌中建立-PGA合成酶復(fù)合體PgsBCA基因表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)-聚谷氨酸高效工程菌株的構(gòu)建；獲取參與-PGA合成酶基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)基因信息。與申請者研究工作長期目標(biāo)的關(guān)系：我們近幾年來一直在谷氨酸棒桿菌方面開展大量的科研工作, 并與德國科研機(jī)構(gòu)建立了長期的科研協(xié)作關(guān)系。該項(xiàng)目研究工作的開展, 是以往工作經(jīng)驗(yàn)的運(yùn)用和發(fā)揮, 有助于實(shí)現(xiàn)-聚谷氨酸高效工程菌株的構(gòu)建。今后我們將不

21、斷關(guān)注企業(yè)的需要，和企業(yè)攜手進(jìn)行新產(chǎn)品開發(fā)，而且還將繼續(xù)致力于谷氨酸棒桿菌代謝調(diào)控理論研究，提升該系統(tǒng)的綜合研究實(shí)力，確保其達(dá)到新的科技高度，這些是我們實(shí)驗(yàn)室的長期目標(biāo)。3、項(xiàng)目研究內(nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排研究內(nèi)容1） 以現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室保存菌株谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC-13032、res 167和省內(nèi)氨基酸生產(chǎn)廠家提供的高產(chǎn)菌為系列出發(fā)菌株, 構(gòu)建三個(gè)酶基因pgsB、pgsA和pgsC的系列重組表達(dá)載體，選取pgsBAC、pgsBA、pgsAC和pgsBC等不同基因組合體，然后在谷氨酸棒桿菌中建立基因過量表達(dá)體系和基因整合體系，比較分析基因表達(dá)產(chǎn)物

22、，構(gòu)建-聚谷氨酸高效工程菌株，以實(shí)現(xiàn)-PGA合成酶復(fù)合體酶活性穩(wěn)定高表達(dá)和-PGA高產(chǎn)合成。2） 引入轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模-PGA異常代謝的插入突變菌株的篩選。采用轉(zhuǎn)座子挽救法對-PGA的插入突變菌株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行定位分析, 獲取一組目標(biāo)基因信息，從而獲取合成途徑中可能起激活或阻遏作用的調(diào)控因子的相關(guān)基因信息，探討谷氨酸棒桿菌-PGA高效合成的代謝調(diào)控機(jī)理。本項(xiàng)目按以下方案和技術(shù)路線實(shí)施二 -聚谷氨酸合成代謝調(diào)控機(jī)理研究一 -聚谷氨酸高效工程菌株構(gòu)建 高產(chǎn)谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)，構(gòu)建pgsBCA基因重組表達(dá)載體，建立基因過量表達(dá)體系建立突變生長檢測系統(tǒng)，篩選插入突變菌株表達(dá)菌株酶學(xué)特征

23、比較和產(chǎn)物分析，獲知pgsBCA基因三個(gè)組分在-聚谷氨酸合成中的作用轉(zhuǎn)座子挽救法定位分析，尋找插入位點(diǎn)處的目標(biāo)基因序列采用基因整合技術(shù)引入多個(gè)pgsBCA基因至谷氨酸棒桿菌染色體上，構(gòu)建基因穩(wěn)定表達(dá)菌株尋找涉及-聚谷氨酸合成酶基因表達(dá)的調(diào)控蛋白基因信息-聚谷氨酸產(chǎn)物分析和理化性質(zhì)鑒定，以篩選-聚谷氨酸合成高效工程菌株主要實(shí)驗(yàn)手段和方法1） 菌種培養(yǎng)采用luria Bertani (LB) 培養(yǎng)基作為谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌為常規(guī)培養(yǎng)基(Sambrook,1989); 谷氨酸棒桿菌基本培養(yǎng)基成分參見Eikmanns 方法(1991, App. Microbiol. Biochem,

24、34,612-617) 。常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基基本成分(可適當(dāng)添加谷氨酸等其他成分)：葡萄糖110，蛋白胨28， MgSO4 0.050.5%，NaCl 18%，K2HPO4 0.010.05，pH69，裝液量20200ml/500ml搖瓶，115121滅菌1530分鐘，滅菌結(jié)束后，冷卻，接種，接種量為110，2040搖瓶培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100400rpm，在上述條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)2472小時(shí)，測定-聚谷氨酸的產(chǎn)量。 2） -聚谷氨酸合成酶復(fù)合體三個(gè)組分基因克隆采用PCR擴(kuò)增手段，參照文獻(xiàn)方法10-12，以本實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌菌種中提取的染色體DNA為模板，設(shè)計(jì)上下游引物片段（PPGSB-

25、NF2和PPGSB-CR）擴(kuò)增出1.2kb大小的pgsB基因片段；采用PPGSC-NF和PPGSC-CR2上下游引物片段擴(kuò)增出1.4kb大小的pgsC基因片段； 同樣PPGSA-NF和PPGSB-CR2上下游引物片段擴(kuò)增出0.45kb大小的pgsA基因片段。對這些基因片段經(jīng)酶切割后連接至克隆載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌保存，并測定DNA序列。3） 基因過量表達(dá)菌株建立 選取實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的保存質(zhì)粒：大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭質(zhì)粒（pXNJ19、pEK0、pEK EX1、pEK EX2）等為表達(dá)載體。參照文獻(xiàn)29,30將三個(gè)酶基因組分通過酶切連接后產(chǎn)生基因重組片段pgsBAC、pgsBA、pgsAC和pg

26、sBC等，然后在谷氨酸棒桿菌中分別建立這些基因重組片段的過量表達(dá)載體。各個(gè)基因組合可經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、產(chǎn)物分析來確定其功能。4） 基因整合菌株建立參照文獻(xiàn)方法17-19,29,30 ，首先根據(jù)谷氨酸棒桿菌基因庫DNA序列特征，設(shè)計(jì)基因整合的靶位點(diǎn)。待整合的目標(biāo)基因片段經(jīng)EcoRI酶切后克隆到含有KmR的基因取代載體pK19mobsacB 中, 在E. coli DH5中構(gòu)建重組質(zhì)粒。 采用基因重組交換技術(shù), 將已克隆的重組質(zhì)粒通過高效電激轉(zhuǎn)化, 分別導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行DNA重組; 載體含有KmR基因。在含卡那霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行初次篩選以獲得第一次重組, 即載體DNA在谷氨酸棒桿菌染色體上的定點(diǎn)整合

27、; 由于載體又含有sacB基因, 不能使菌體在含10% 蔗糖的基質(zhì)上生長, 因此以蔗糖為基質(zhì)進(jìn)行再次篩選可排除載體DNA, 載體與染色體DNA發(fā)生第二次重組, 并不再具有卡那霉素抗性; 其中再重組結(jié)果將因重組位點(diǎn)的差異而不同, 通過PCR方法和Southern 雜交法可確定基因整合情況。5） 轉(zhuǎn)座子插入突變菌株篩選 將含轉(zhuǎn)座子Tn5531和卡那霉素抗性的質(zhì)粒pCGL0040通過電激轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入事先構(gòu)建好的藍(lán)白斑生長檢測菌株，以谷氨酸棒桿菌野生型為對照菌株, 在四環(huán)素和卡那霉素雙抗平板上篩選雙抗轉(zhuǎn)化子, 然后將雙抗轉(zhuǎn)化子進(jìn)行藍(lán)白斑生長檢測誘導(dǎo)，并將藍(lán)白斑顯示不同于原始菌株的可疑菌株進(jìn)一步-PGA

28、成分分析, 篩選-PGA產(chǎn)量異常的菌株為插入突變的目標(biāo)菌株。6） 轉(zhuǎn)座子挽救法定位分析轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn) 對已篩選到的-PGA合成目標(biāo)突變株, 通過其轉(zhuǎn)座子及插入位點(diǎn)附近的序列的克隆分離, 進(jìn)一步測定插入位點(diǎn)相鄰DNA序列, 可獲得轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)處的DNA序列, 從而達(dá)到轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)處目標(biāo)基因的精確定位。由于本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)座子基因兩側(cè)具有EcoRI 和 XbaI酶切位點(diǎn), 可將篩選到的轉(zhuǎn)座子突變菌株進(jìn)行染色體 DNA分離 并且將之分別進(jìn)行EcoRI 和 XbaI酶切, 回收各自的酶切片段克隆至帶有AmpR 抗性標(biāo)記的pUC18載體中, 轉(zhuǎn)化E. coli DH5, 在含有50mg/ml那霉素 和50m

29、g/ml氨芐青霉素的雙抗篩選培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子, 對EcoRI 酶切片段克隆轉(zhuǎn)化子以及XbaI 酶切片段克隆的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒的檢測。檢測插入片段大小和方向, 挑不同轉(zhuǎn)化子, 抽提質(zhì)粒后以Tn5531序列設(shè)計(jì)的引物 TnEco (5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3')和 TnXba (5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3') 進(jìn)行DNA序列測定, 與谷氨酸棒桿菌基因庫的序列進(jìn)行比較分析獲得插入位點(diǎn)序列，即目標(biāo)基因序列。7） -聚谷氨酸合成酶成分提取和酶活性分析 -聚谷氨酸合成酶成分提?。簠⒄瘴墨I(xiàn)進(jìn)行10

30、-12?；虮磉_(dá)菌株在30ºC 下誘導(dǎo)表達(dá)4-8小時(shí)后，將培養(yǎng)液8000g離心30分鐘后收集細(xì)胞沉淀并取上清。上清中加入70%硫酸銨沉淀，12000g高速離心1小時(shí)獲得酶蛋白沉淀，將沉淀溶于含有甘油和二硫蘇糖醇成分的Tris-HCl緩沖液中，4ºC透析過夜收集胞外酶組分；細(xì)胞沉淀懸浮于緩沖液并進(jìn)行4ºC超聲波粉碎，然后將上清液進(jìn)行12000g高速離心1小時(shí)和56000g超速離心30分鐘的分步沉淀后收集上清，上清為胞質(zhì)可溶性酶組分，沉淀懸浮于緩沖液中獲得細(xì)胞膜成分中的酶組分。 -聚谷氨酸合成酶活性分析：根據(jù)-聚谷氨酸合成酶復(fù)合體中的關(guān)鍵酶PgsB為酰胺鍵連接酶，有依

31、賴于谷氨酸的ATP水解酶特性，因此可通過測定ATP水解酶活性來間接測定-聚谷氨酸合成酶活性。具體方法可參見文獻(xiàn)11。8） -聚谷氨酸的分離純化采用有機(jī)溶劑沉淀法。利用離心的方法去除發(fā)酵液中的菌體，用鹽酸將上清液的pH值調(diào)至35，然后加入低級(jí)有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇，丙酮等，加入量為上清液體積的25倍，沉淀得到-聚谷氨酸。將沉淀物重新溶解在100倍體積水中，過濾除去不溶物，然后透析除去小分子物質(zhì)，最后將溶液冷凍干燥得到白色粉末狀物質(zhì)，此白色物質(zhì)為-聚谷氨酸。9） -聚谷氨酸理化性質(zhì)鑒定 溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑；茚三酮發(fā)應(yīng)呈陰性，用6MHCl水解后茚三酮反應(yīng)呈陽性；6MHCl水解后

32、用HPLC和薄層層析法檢測，分析水解物中是否生成單一氨基酸谷氨酸。證明該聚合物為谷氨酸的高分子聚合物；通過SDSPAGE和凝膠過濾色譜等方法分析該聚合物的分子量。年度研究計(jì)劃：本課題計(jì)劃二年內(nèi)完成。具體安排和進(jìn)度如下：第一年度（2006,1-12）：在谷氨酸棒桿菌中篩選谷氨酸高產(chǎn)菌株，建立pgsBAC基因過量表達(dá)體系和基因整合體系，構(gòu)建-PGA高效工程菌株。第二年度（2007,1-12）： 引入轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模-PGA異常代謝的插入突變菌株的篩選；采用轉(zhuǎn)座子挽救法定位分析, 獲取參與-PGA合成酶基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)基因信息；撰寫論文和總結(jié)報(bào)告。4、項(xiàng)目創(chuàng)新之處本項(xiàng)目考慮利用谷氨酸生

33、產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌17-21進(jìn)行生產(chǎn)-PGA嘗試, 開展-PGA合成酶復(fù)合體基因pgsBCA表達(dá)載體的構(gòu)建，以期實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌中的-PGA高效表達(dá)，這是本項(xiàng)目的特色之一。 此外，利用谷氨酸棒桿菌中成熟的轉(zhuǎn)座子突變篩選技術(shù)和基因定向分析方法，進(jìn)一步從分子水平角度研究谷氨酸棒桿菌-PGA合成的代謝調(diào)控作用機(jī)理，尋找基因工程技術(shù)對-PGA合成的有效調(diào)整作用。該項(xiàng)目研究結(jié)果將填充國內(nèi)外-PGA合成代謝調(diào)控模式理論，是本項(xiàng)目的又一特色。5、工作基礎(chǔ)與工作條件本項(xiàng)目申請人在攻讀本科、碩士和博士學(xué)位期間，一直從事微生物生化、分子生物學(xué)和生物工程學(xué)領(lǐng)域的學(xué)習(xí)和研究，具有扎實(shí)的微生物學(xué)系統(tǒng)理論知識(shí)和嫻熟的基因

34、工程實(shí)驗(yàn)操作技能。申請人曾參加了多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的研究工作，博士期間完成了谷氨酸棒桿菌的乙酸代謝調(diào)控研究，在轉(zhuǎn)座子突變菌株中尋找并分離到了一個(gè)與乙酸代謝調(diào)控相關(guān)的輔阻遏蛋白基因，并由該基因的過量表達(dá)菌株和缺失菌株的構(gòu)建和分析得以證實(shí)，在該微生物基因定點(diǎn)缺失和調(diào)控基因研究等方面積累了寶貴經(jīng)驗(yàn)，已具備了獨(dú)立承擔(dān)該課題的工作能力。 特別是本實(shí)驗(yàn)室從去年下半年開始, 著手進(jìn)行了-PGA合成酶基因克隆及其表達(dá)的課題研究, 已經(jīng)成功地從枯草桿菌染色體上分別克隆得到-PGA合成酶的三個(gè)酶基因pgsB、pgsA和pgsC，序列分析結(jié)果與報(bào)道的一致，這為本課題的開展提供了很好的工作支撐。在谷氨酸棒桿菌中

35、構(gòu)建基因過量表達(dá)體系方面, 我們也有成功的經(jīng)驗(yàn)，加上實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的過量表達(dá)載體（大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭質(zhì)粒，如pXNJ19、pEK0、pEK EX1、pEK EX2等）和染色體基因取代整合載體（pK19mobsacB）行之有效，進(jìn)行目標(biāo)基因過量表達(dá)和基因染色體定點(diǎn)整合不存在技術(shù)障礙。另外，我們的科研意向不僅獲得了省內(nèi)氨基酸生產(chǎn)行業(yè)知名企業(yè)的關(guān)注和菌種支持, 還得到了德國方面的大力支持，德國導(dǎo)師具有長期谷氨酸棒桿菌代謝調(diào)控研究的獨(dú)到經(jīng)驗(yàn)，在該領(lǐng)域中已建立了一系列很完善的科研體系，這些都將大大有利于本項(xiàng)目工作的開展。本項(xiàng)目組成員中既有從事微生物生化、分子生物學(xué)和酶工程的教師，又有碩士生參加，全

36、體人員通力合作能夠保證本項(xiàng)目的順利進(jìn)行。目前本實(shí)驗(yàn)室已有的主要設(shè)備：PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、OLYPUS相差顯微鏡、層析儀、電激轉(zhuǎn)化儀、核酸蛋白檢測儀、酶分析儀、紫外分光光度計(jì)、控溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀等，已擁有開展本項(xiàng)目研究工作的實(shí)驗(yàn)室條件和儀器。本單位與某高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及中科院某研究所建立了長期的科研協(xié)作關(guān)系，有共同培養(yǎng)碩士生協(xié)議,公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)各種儀器可共享共用，這將更加有利于本項(xiàng)目的進(jìn)一步開展。6、預(yù)期研究結(jié)果及其利用研究結(jié)果的計(jì)劃和今后發(fā)展的思路預(yù)期研究結(jié)果1） 構(gòu)建13株-PGA高效工程菌株，以期在小型發(fā)酵罐中無需添加大量的谷氨酸原料進(jìn)行發(fā)酵，可達(dá)到20 g/L以上的穩(wěn)定高產(chǎn)

37、量。2） 獲取參與-PGA合成酶基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)信息。3） 預(yù)期發(fā)表1篇以上SCI研究論文，培養(yǎng)2名碩士研究生。利用研究結(jié)果的計(jì)劃和今后發(fā)展的思路今后還將繼續(xù)致力于谷氨酸棒桿菌代謝調(diào)控理論研究，提升該研究系統(tǒng)的綜合實(shí)力；另外，我們科研發(fā)展重心將努力尋求和開拓生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化道路， 尋求更廣泛的企業(yè)投資力度。7、參考文獻(xiàn)1. Tanaka T, et al. Existence of an optically heterogeneous peptide unit in poly(-glutamic acid) produced by Bacillus subtilisBacillus subt

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