2 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、2. 細(xì)胞生物學(xué)研究方法2.1 顯微成像技術(shù)2.1.1 光學(xué)和電子顯微鏡成像原理2.1.2 常用的光學(xué)顯微鏡2.1.3 光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察2.1.4 電子顯微鏡2.1.5 間接成像技術(shù)2.2 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.2.1 酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.2.3 細(xì)胞分選技術(shù)2.2.4 其他細(xì)胞化學(xué)技術(shù)2.3 細(xì)胞工程技術(shù)2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)2.3.2 細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)2.3.3 動(dòng)物細(xì)胞核移植克隆技術(shù)2.4 分離技術(shù)2.4.1 離心分離技術(shù)2.4.2 層析分離技術(shù)2.5 分子生物學(xué)方法2.5.1 基因工程技術(shù)2.5.2 PCR技術(shù)2.5.3 選擇性基因敲除與轉(zhuǎn)基因鼠2.

2、5.4 乳腺生物反應(yīng)器技術(shù)2. 細(xì)胞生物學(xué)研究方法生命科學(xué)是實(shí)驗(yàn)科學(xué)，它的很多成果都是通過(guò)實(shí)驗(yàn)得以發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的。方法上的突破，對(duì)于理論和應(yīng)用上的發(fā)展具有巨大的推動(dòng)作用。2.1 顯微成像技術(shù)最早的光學(xué)顯微鏡是1590年Z.Janssen和他的侄子H.Janssen共同研制的。其后，Robert Hooke和Antonie van Leeuwenhoek對(duì)光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)進(jìn)行了極大的改進(jìn)，由此發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞。20世紀(jì)30年代發(fā)展起來(lái)的電子顯微鏡導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)生了一次革命，使生物學(xué)家得以從亞顯微水平上重新認(rèn)識(shí)細(xì)胞(圖2-1)。圖2-1 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)  2.1

3、.1 光學(xué)和電子顯微鏡成像原理不管是何種顯微鏡，鏡像的形成都需要三個(gè)基本要素:照明系統(tǒng)， 被觀察的樣品，聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)(圖2-2)。圖2-2 光學(xué)和電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡中，照明系統(tǒng)是可見(jiàn)光，使用的是玻璃透鏡系統(tǒng)，可直接通過(guò)目鏡觀察鏡像。在電子顯微鏡中，照明系統(tǒng)為電子束，使用電磁透鏡，通過(guò)熒光屏觀察樣品的鏡像。照明系統(tǒng)的波長(zhǎng)是顯微鏡成像的一個(gè)重要因素，因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)決定能被檢測(cè)樣品的最小極限。波長(zhǎng)越長(zhǎng)，波幅的跨度就越大，所能觀察到的物體極限就越大(圖2-3)。圖2-3 波的移動(dòng)、波長(zhǎng)和干擾 請(qǐng)對(duì)圖2-3作出說(shuō)明光學(xué)和電子顯微鏡成像的光學(xué)原理是相同的，其中最重要的是光子和電子

4、都具有波的行為。當(dāng)光子和電子穿過(guò)透鏡到達(dá)聚焦點(diǎn)時(shí)，由于波的干涉(interference)性質(zhì)而成像。實(shí)際上通過(guò)透鏡觀察到的樣品的鏡像是通過(guò)透鏡波的干涉累加或消除，即衍射(diffraction)的結(jié)果。焦距與角孔徑焦距(focal length)是透鏡的中心平面到焦點(diǎn)的距離(圖2-4)，而角孔徑(angular aperture)是光從樣品進(jìn)入顯微鏡的物鏡半角(圖2-5)，因此角孔徑實(shí)際表示有多少光離開樣品通過(guò)透鏡， 最好的光學(xué)顯微鏡的角孔徑大約是700。圖2-4 透鏡的焦距圖2-5 透鏡的角孔徑角孔徑是光從樣品進(jìn)入透鏡的半角。(a)小孔徑透鏡;(b)大角孔徑透鏡。角孔徑越大，透過(guò)透鏡的信息

5、越多，最好的玻璃透鏡的角孔徑大約是700   分辨率(resolution)透鏡最重要的性質(zhì)就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式計(jì)算: R = 0.61 /n Sin其中:n=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率. 空氣為1. 油為1.5; =樣品對(duì)物鏡角孔徑的半角， sin的最大值為1;=照明光源的波長(zhǎng)。0.61是一個(gè)恒定的參數(shù)，表示成像的點(diǎn)雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度。上式中n Sin的量稱為物鏡的數(shù)值孔徑(numeric aperture)，縮寫為NA， 因此顯微鏡的分辨率的表示公式可改為:R=0.61 /NA從上式可知，角孔徑越大，進(jìn)入物鏡的光越多；介質(zhì)的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大

6、，這些都可以使分辨率提高。由于分辨率表示的是能夠區(qū)別兩個(gè)點(diǎn)間最近距離的能力，所以R值越小，分辨率越高。從分辨率的表達(dá)式來(lái)看，NA越大，分辨率越高，或者波長(zhǎng)越短，分辨率越高。  分辨極限(limit resolution)與放大率(magnification)一般地說(shuō)，一定波長(zhǎng)的射線不能用以探查比它本身波長(zhǎng)短得多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，這是一切顯微鏡的一個(gè)基本限度。對(duì)可見(jiàn)光來(lái)說(shuō)，能清楚地分辨出相鄰兩點(diǎn)之間的最小間隔是0.2 m，稱之為分辨極限(limit resolution)。最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率?？偡糯舐?= 物鏡放大率×目鏡放大率， 放大率同樣受分辨極限的限制

7、。一般來(lái)說(shuō)， 光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是透鏡的數(shù)值孔徑的1000倍。由于透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是1.01.4，所以光學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時(shí)最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡則為1400倍。增大角孔徑或縮短波長(zhǎng)可提高光學(xué)顯微鏡的分辨率。如果用波長(zhǎng)比普通波長(zhǎng)短得多的電子波代替光波，分辨率可大大提高，電子顯微鏡就是在這種需求下被發(fā)明的。表2-1是光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡某些特性的比較。表2-2 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別 分辨本領(lǐng)光源透鏡真空光學(xué)顯微鏡300 nm可見(jiàn)光玻璃透鏡不需真空200 nm(油鏡)可見(jiàn)光玻璃透鏡不需真空100 nm紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1 nm電子

8、束電磁透鏡真空 2.1.2 常用的光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡(light microscope)是光學(xué)顯微技術(shù)的主要工具，自問(wèn)世以來(lái)已有400多年歷史。光學(xué)顯微鏡是利用光線照明，使微小物體形成放大影像的儀器?，F(xiàn)今使用的光學(xué)顯微鏡都是由幾個(gè)透鏡組合而成，所以又稱為復(fù)合顯微鏡(compound microscope)(圖2-6)。 圖2-6 普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 普通雙筒顯微鏡(binocular microscope)比較高級(jí)的顯微鏡上都設(shè)有傾斜式的雙目鏡筒(圖2-7)。在物鏡轉(zhuǎn)換器上方裝有四個(gè)棱鏡，使經(jīng)過(guò)物鏡的光線平分為兩路到達(dá)目鏡，故雙筒顯微鏡的亮度要比單筒者為暗。雙筒顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)為

9、同時(shí)用兩眼觀察，有較強(qiáng)的立體感。圖2-7 雙筒顯微鏡 熒光顯微鏡(fluorescence microscope)熒光顯微鏡的工作原理是利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線光源， 通過(guò)照明設(shè)備把顯微固定的切片或活染的細(xì)胞透視出來(lái)，基本成像原理示于圖2-8。圖2-8 熒光顯微鏡的光通路 相差顯微鏡(phase contrast microscope)相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計(jì)，尤其是光學(xué)系統(tǒng)有很大的不同(圖2-9)， 可用于觀察未染色的活細(xì)胞(圖2-10)。圖2-9 相差顯微鏡的光學(xué)部件及光線通路圖2-10 相差顯微鏡觀察的活細(xì)胞 暗視野顯微鏡(dark field m

10、icroscope)暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器使照明光線不能進(jìn)入物鏡被放大，在黑暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子(圖2-11)。圖2-11 暗視野顯微鏡的光學(xué)暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造， 適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。 倒置顯微鏡倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成與普通顯微鏡一樣， 所不同的只是它的物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過(guò)來(lái)。前者置于載物臺(tái)之下， 而后者在載物臺(tái)的上方。集光器與載物臺(tái)之間的工作距離提高， 可以放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器， 直接對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察(圖2

11、-12)圖2-12 倒置顯微鏡 2.1.3 光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察由于大多數(shù)細(xì)胞的成分不影響光線的穿透，無(wú)法形成反差，所以在一般光學(xué)顯微鏡下，幾乎看不清未經(jīng)處理的細(xì)胞。為了看清細(xì)胞內(nèi)含物，就必須對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行一些特殊的處理，為此建立和發(fā)展了樣品的各種制備技術(shù)。   樣品的固定(fixation) 目的: 生物組織在染色前先進(jìn)行固定的目的是殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成份，并且使樣品硬化以便在進(jìn)一步的處理和切片時(shí)不會(huì)受到破壞。 做法: 樣品固定的最簡(jiǎn)單做法是將樣品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過(guò)程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象

12、。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價(jià)鍵，從而將鄰近的蛋白質(zhì)分子牢固地交聯(lián)在一起。  包埋和切片(embedding and sectioning)樣品制備的第二步是將固定的組織制備成切片。為此，樣品首先要被包埋在介質(zhì)中，通常用液態(tài)的石蠟或樹脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，然后將之硬化成固體的包埋塊，隨后用專門的切片機(jī)切割包埋塊，制備成薄切片(圖2-13)。適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為 l10 m。圖2-13 用切片機(jī)進(jìn)行樣品切片  染色(staining)大多數(shù)細(xì)胞總重量的70%是水，對(duì)可見(jiàn)光幾乎是透明的，只有很少的內(nèi)含

13、物不透光。染色的目的就是給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。19世紀(jì)初，發(fā)現(xiàn)某些有機(jī)染料可染生物組織，并對(duì)細(xì)胞特殊部位的著色具有選擇性。如蘇木精(hematoxylin)對(duì)負(fù)電荷分子有親和性，能顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布；酸性染料如伊紅(eosin)可使細(xì)胞質(zhì)染色；蘇丹染料(Sudan dyes)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著色。但對(duì)許多染料的特異性染色機(jī)理尚不清楚。  細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(cytochemistry) 采用比有機(jī)染料更為特異的染色劑及酶細(xì)胞化學(xué)方法，可以了解細(xì)胞和組織中大致的化學(xué)組成，及某些活性基團(tuán)或酶的存在。 為了測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類，常利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中特殊基團(tuán)的特異性結(jié)合，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中出現(xiàn)的部位和顏色顯示的程度，從而判斷被檢物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。例如，利用Feulgen反應(yīng)(圖2-14)可特異性檢測(cè)細(xì)胞中的DNA，PAS反應(yīng)可