半胱氨酸蛋白酶和消化系腫瘤化療

1、半胱氨酸蛋白酶和消化系腫瘤化療    摘要  半胱氨酸蛋白酶（Caspases）激活級聯(lián)反應(yīng)在凋亡調(diào)控中占核心作用，它涉及2條主要途徑：死亡介導(dǎo)途徑和線粒體依賴途徑。不同的凋亡刺激信號經(jīng)各自特定途徑的起始不同的Caspases級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)Caspases，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞毒化療藥物通過半胱氨酸蛋白酶而誘導(dǎo)消化系腫瘤細(xì)胞凋亡。目前，通過調(diào)節(jié)Caspases的活性促使癌細(xì)胞凋亡是腫瘤治療研究中一個值得探索的領(lǐng)域。        關(guān)鍵詞  半胱氨酸蛋白

2、酶；細(xì)胞凋亡；消化系腫瘤；化療        近年來，隨著研究的深入，在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種半胱氨酶蛋白酶。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相似的酶構(gòu)成了一個蛋白酶家族，稱之為Caspases家族。它是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要酶類。這些蛋白酶在細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制和在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療中的意義，是腫瘤學(xué)基礎(chǔ)及臨床研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本文就Caspases與細(xì)胞凋亡、凋亡調(diào)控基因、消化系腫瘤及化療的關(guān)系作一簡要綜述如下。        1  Caspases家族概述 

3、0;      1993年Yuan等發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲的Ced-3基因與哺乳動物細(xì)胞ICE（interleakin-1 converting enzyme）存在功能和序列上的高度同源，與ced-3一樣ICE高表達(dá)可導(dǎo)致嚙齒動物成纖維細(xì)胞凋亡。目前在哺乳動物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)有14種ICE/ced-3蛋白酶家族成員1，命名為半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific protease），簡稱Caspases，有學(xué)者稱之為“半胱天冬酶”。它們具有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性。許多Caspases在哺乳動物的細(xì)胞凋亡中發(fā)

4、揮重要的作用。細(xì)胞凋亡是從內(nèi)外多因子復(fù)雜的相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡信號，傳遞至Caspases，并使其活化為開始，以蛋白底物裂解、細(xì)胞解體為結(jié)局，從而使細(xì)胞凋亡得以完成。因此，對于Caspases的深入研究將對其依賴的細(xì)胞凋亡相關(guān)腫瘤和疾病有可能提供治療的又一新靶點(diǎn)，從而為基因治療提供新的途徑。        1.1  Caspases的生物學(xué)特性  Caspases最初表達(dá)為蛋白酶的形式，基本結(jié)構(gòu)包括：N端結(jié)構(gòu)域參與酶功能激活調(diào)節(jié)及大、小亞基提供與底物結(jié)構(gòu)及催化所需的氨基酸。Caspases可專一、高效地特異性水解一

5、系列的蛋白底物，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能        喪失或改變2。Caspases按功能分為啟動子Caspases即Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、Caspases-10和效應(yīng)子Caspases，即Caspases-3、Caspases-6、Caspases-7。效應(yīng)子被啟動激活，執(zhí)行最終的凋亡效應(yīng)，Caspases-3（CPP32）是最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一3。而啟動子Caspases則被特定的結(jié)合蛋白、其他Caspases及本身激活4。這些結(jié)合蛋白質(zhì)將凋亡信號和Caspases聯(lián)系起來，決定2種基本

6、凋亡途徑：線粒體途徑和死亡受體途徑。最近報道的第3條途徑是小鼠體內(nèi)的Caspases-12介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)因特異性凋亡5。        1.2  Caspases與調(diào)控基因        1.2.1  p53基因  p53基因作為一種轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)或抑制很多與細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)（如p21和Bax等）。因此，p53可通過直接或間接調(diào)節(jié)凋亡通路中多個關(guān)鍵因子而調(diào)控凋亡。Burns6的研究發(fā)現(xiàn)人腫瘤細(xì)胞過表達(dá)p53能誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，而特異性抑制劑分

7、別抑制了Caspases-8及Caspases-9后均能抑制這種p53依賴的凋亡。Fuchs等發(fā)現(xiàn)放射損傷引起的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡時，p53依賴于Caspases-3的活化。但p53亦能抑制昆蟲、線蟲、哺乳動物細(xì)胞的凋亡，p53阻斷細(xì)胞凋亡機(jī)制在于與Caspases家族成員（包括Caspases-1、Caspases-2、Caspases-3、Caspases-4）形成p53-Caspases復(fù)合體，從而抑制Caspases催化活性。        1.2.2  Bcl-2家族  Bcl-2家族迄今為止發(fā)現(xiàn)的Bcl-

8、2家族同源蛋白不少于15種，均含有1種以上Bcl-2家族共同源序列（BH1-BH4）。按結(jié)構(gòu)功能不同分為前凋亡蛋白（preapoptotic protein）和抗凋亡蛋白（antiapoptotic protein）。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白過表達(dá)使許多本可致PT孔（permeability transition pore，PTP）開放，細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）釋放的刺激失效，Caspases活化降低，從而抑制凋亡；而前凋亡蛋白（又稱凋亡蛋白）Bax過表達(dá)導(dǎo)致線粒體跨膜電位缺失及細(xì)胞色素C釋放，導(dǎo)致Caspases活化增強(qiáng)，促進(jìn)凋

9、亡。另外，Bcl-2C末端產(chǎn)物能觸發(fā)細(xì)胞凋亡，裂解產(chǎn)物進(jìn)一步激活下游的Caspases，并導(dǎo)致Caspases級聯(lián)反應(yīng)放大。        1.2.3  Cmyc基因  Cmyc基因是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要基因，其表達(dá)產(chǎn)物Cmyc蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子。在Cmyc介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，可見Caspases-3進(jìn)入活化狀態(tài)，當(dāng)其選擇性抑制時，能部分抑制Cmyc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明Caspases蛋白酶家族，尤其是Caspases-3參與了Cmyc介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑7。     

10、0;  此外，還有一系列蛋白稱為凋亡抑制因子（inhibitors of apoptosis，IAP），具有直接阻止凋亡作用，IAP與Caspases蛋白酶結(jié)合可使后者失活。雖然其抑制目標(biāo)還不清楚，但在體外實(shí)驗(yàn)中可抑制Caspases-3和Caspases-7；CrmA亦能抑制某些啟動性Caspases，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生；TGF能阻止神經(jīng)鞘氨醇誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞中Caspases-3活化，抑制細(xì)胞凋亡。以上說明各不同調(diào)控基因與Caspases關(guān)系密切，且影響Caspases蛋白酶的活化，進(jìn)而促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡。       

11、; 2  Caspases與細(xì)胞凋亡        1972年Kerr等8根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，首次提出細(xì)胞凋亡（apoptosis）這一概念。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PDC），是一種基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程。它是多細(xì)胞生物體內(nèi)的一個重要生命征象，既出現(xiàn)在個體發(fā)育過程中，也出現(xiàn)在正常生理狀態(tài)或疾病中；既在體內(nèi)發(fā)生，也出現(xiàn)在體外培養(yǎng)物中。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變。        2.1  形態(tài)學(xué)改變&#

12、160; 細(xì)胞凋亡涉及單個細(xì)胞成為非同步發(fā)生的一小部分細(xì)胞。先為單個細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，細(xì)胞皺縮、胞質(zhì)凝縮、細(xì)胞器聚集、核染色逐漸濃集。以后胞核固縮、碎裂，細(xì)胞下陷包裹碎片和細(xì)胞器，形成包膜完整的凋亡小體（apoptotic bodies）。凋亡小體很快被鄰近的細(xì)胞吞噬降解。        2.2  生物化學(xué)改變  （1）鈣離子和蛋白激酶改變：細(xì)胞內(nèi)Ca2+的堆積和重新分布，細(xì)胞核內(nèi)Ca2+增多，激活核酸內(nèi)切酶的活性；（2）核酸內(nèi)切酶激活把DNA降低成180200堿基對倍數(shù)的核苷酸片段，呈梯狀電泳現(xiàn)象；（3）組織谷

13、氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的積累并激活；（4）細(xì)胞骨架如肌動蛋白的變化；（5）細(xì)胞表面糖鏈、植物血凝素與玻連蛋白的受體增加，磷酯酰氨酸的外露可改變細(xì)胞表面的生化特性。隨著對細(xì)胞凋亡的研究深入，目前學(xué)者們認(rèn)為Caspases是細(xì)胞凋亡機(jī)制中重要的效應(yīng)因子之一，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)14種Caspases家族成員，其中至少2/3的Caspases與細(xì)胞凋亡相關(guān)并參與多種與凋亡有關(guān)的機(jī)體生理性或病理性過程。        3  Caspases與消化系腫瘤        以往對腫瘤的研究，

14、多認(rèn)為腫瘤細(xì)胞無限增殖是腫瘤形成的關(guān)鍵。近年來，隨著對細(xì)胞凋亡研究的深入，人們越來越重視細(xì)胞凋亡與腫瘤的關(guān)鍵，認(rèn)識到組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定實(shí)際上是細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡?，F(xiàn)認(rèn)為在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段均存在細(xì)胞凋亡，與Caspases家族有著密切關(guān)系。消化系腫瘤亦是如此。Hoshi等9研究33例人胃癌組織發(fā)現(xiàn)，Caspases-3的表達(dá)較正常組織明顯降低，提示Caspases介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的異常降低可能與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)；國內(nèi)林萬隆等10對50例胃癌組織中Caspases-3和bclx2表達(dá)的研究結(jié)果與Hoshi報道一致。在肝癌的研究中，Medema等認(rèn)為Caspases-3、Caspases-

15、8參與了Fas介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌凋亡；Hasegawa等研究發(fā)現(xiàn)Caspases-3抑制劑DEVDCHO能抑制Caspases-3活化從而抑制Fas介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。近年來，孫海晨等11對胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)Caspases-1和Caspases-2在胰腺癌細(xì)胞ASPC-1凋亡過程中起重要作用；而張為強(qiáng)等12在大腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CPP32（Caspases-3）表達(dá)與降低大腸癌的形成有密切關(guān)系；Turnuen等在膽癌的研究中發(fā)現(xiàn)，膽囊癌中有Caspases-3、Caspases-6和Caspases-8的高表達(dá)，且這些蛋白酶的表達(dá)水平隨腫瘤組織凋亡細(xì)胞的增多而增高，提示Caspases在膽囊癌的形

16、成發(fā)展中起重要作用；而國內(nèi)何忠野等13研究表明Caspases-3表達(dá)下調(diào)與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)?？傊珻aspases在消化系腫瘤的形成發(fā)展中有著重要的作用，深入研究Caspases的調(diào)控及Caspases與細(xì)胞凋亡、消化系腫瘤的形成發(fā)展的關(guān)系，有利于腫瘤的治療。        4  Caspases與消化系腫瘤化療        自1993年Kaufmamn等發(fā)現(xiàn)足葉乙甙（VP-16）可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)聚ADP核苷多聚酶（PolyADPRiobsePol

17、yMerase，PARP）裂解，導(dǎo)致DNA斷裂后，大量研究表明，許多抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的作用是通過啟動細(xì)胞凋亡機(jī)制完成的。細(xì)胞凋亡是許多化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長的主要機(jī)制之一，能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為重要指標(biāo)之一。而化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡大多需要有Caspases參與，反義的Caspases-1和Caspases-3強(qiáng)烈抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡。在化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的研究過程中發(fā)現(xiàn)，線粒體依賴的Apaf-1/Caspases-9和非線粒體依賴的FADD/Caspases-8 2條通路中，生長因子去除和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激（化療和放療）往往激活A(yù)paf-1/Caspases-9通路，但2條通路

18、也存在著重疊交叉。近年來，許多學(xué)者對消化系腫瘤的化療與Caspases的關(guān)系做了深入研究。Suzuki等研究認(rèn)為，Caspases-3在多種凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中活性增高；呂軍14等研究表明，與氟尿嘧啶誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過程中Caspases-3活性明顯增高，提示Caspases-3參與了5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡；Micheau等在大腸癌化療的研究中發(fā)現(xiàn)，喜樹堿、5-氟尿嘧啶能通過Fas系統(tǒng)介導(dǎo)激活Caspases級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；而Fuda等亦發(fā)現(xiàn)在大腸癌等化療敏感的腫瘤中，CASP表達(dá)明顯高于腎癌等對化療不敏感的腫瘤，提示CASP在大腸腫瘤化療敏感性中起一定作用；H

19、inz等15在胰腺癌誘導(dǎo)化療中發(fā)現(xiàn)，體外胰腺癌細(xì)胞被轉(zhuǎn)染過表達(dá)的Caspases-3后并不能導(dǎo)致其凋亡發(fā)生，但給予小劑量5-氟尿嘧啶，即可引起Caspases-3活化，大量胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示5-氟尿嘧啶可激活Caspases-3引起胰腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)生?？傊?，Caspases與消化系腫瘤化療關(guān)系密切，能否激活Caspases酶系級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，亦是檢驗(yàn)消化系腫瘤化療藥物療效的一個標(biāo)準(zhǔn)。        5  小結(jié)        盡管Caspases家族

20、與消化系腫瘤化療的研究已取得了很大進(jìn)展，了解了Caspases是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控通路的關(guān)鍵。但仍許多問題尚待解決：目前缺乏體內(nèi)評價Caspases的有效療法；還不清楚體外誘導(dǎo)激活Caspases酶級聯(lián)反應(yīng)與臨床治療效果是否一致；臨床如何利用誘導(dǎo)藥物合理配伍最大程度地降低正常組織的Caspases級聯(lián)反應(yīng)激活，而減少凋亡對正常組織的損傷是值得進(jìn)一步研究的課題。相信隨著對Caspases與消化系腫瘤的研究深入，必將為消化系腫瘤發(fā)病機(jī)制的簡述提供更多的理論依據(jù)，同時為消化系腫瘤治療開辟新的思路和方法。 參考文獻(xiàn)     1  Humke EW，Ni

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