鹽酸頭孢甲肟溶血及血管刺激性實驗

1、實驗報告注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔的血管刺激性試驗及對家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗研究機(jī)構(gòu)名稱： 試驗負(fù)責(zé)人： 試驗及報告者： 試驗起止日期：研究機(jī)構(gòu)地址： 研究機(jī)構(gòu)電話：委托單位名稱： 委托單位地址： 委托單位聯(lián)系電話：目 錄依從性聲明1QAU陳述2摘要31注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔的血管刺激性試驗41.1 樣品制備41.2 動物準(zhǔn)備41.3 實驗步驟41.4 結(jié)果41.5 結(jié)果判斷62注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗82.1 樣品準(zhǔn)備82.2 動物準(zhǔn)備82.3 實驗步驟82.4 結(jié)果92.5 結(jié)果判斷9參考文獻(xiàn)9依從性聲明試驗名稱：注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔的血管刺激性試驗及對家兔紅細(xì)胞體外

2、溶血試驗試驗編號：本試驗是按照中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（國家食品藥品監(jiān)督管理局局令第2號，2003年9月1日生效）完成。試驗過程遵照試驗方案及本機(jī)構(gòu)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，無影響試驗結(jié)果和結(jié)論可靠性的偏移或其它異常情況。本報告如實地反映了試驗材料、試驗方法和試驗結(jié)果。試驗負(fù)責(zé)人： 簽名： 日期： 年 月 日QAU陳述試驗名稱：注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔的血管刺激性試驗及對家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗試驗編號：試驗負(fù)責(zé)人： 為確保試驗?zāi)軌驀?yán)格執(zhí)行試驗方案的內(nèi)容，并按照本機(jī)構(gòu)SOP操作，QAU對試驗方案、試驗實施過程和試驗記錄等進(jìn)行了檢查，并審查了原始數(shù)據(jù)、試驗報告，報告中

3、所述的操作程序、試驗方法和試驗結(jié)果如實地反映了試驗原始資料的內(nèi)容。QAU檢查項目、檢查日期及報告日期如下：檢查項目檢查日期報告試驗負(fù)責(zé)人日期報告機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)人日期試驗方案2011.11.022011.11.042011.11.04標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)2011.11.072011.11.092011.11.09試驗過程2011.11.142011.11.162011.11.16試驗記錄2011.12.062011.12.082011.12.08原始數(shù)據(jù)2011.12.072011.12.092011.12.09試驗過程2012.01.062012.01.082012.01.08試驗記錄92012.

4、01.112012.01.11原始數(shù)據(jù)92012.01.112012.01.11試驗報告2012.01.132012.01.162012.01.16試驗QA： 簽名： 日期： 年 月 日QAU負(fù)責(zé)人： 簽名： 日期： 年 月 日摘要本試驗包括注射用鹽酸頭孢甲肟（規(guī)格：1 g/瓶）對家兔的血管刺激性試驗及對家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗。注射用鹽酸頭孢甲肟，1 g/瓶，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號100801。本品主要成分為鹽酸頭孢甲肟，為白色至微黃色結(jié)晶性粉末。用法與用量：1.成人：輕度感染：一日1-2g，分2次靜脈滴注；中、重度感染：可增至一日4g，分2-4次靜脈滴注。也可根據(jù)臨床情況進(jìn)行劑

5、量調(diào)整。2.小兒：輕度感染：一日每公斤體重40-80mg，分3-4次靜脈滴注；中、重度感染：可增至一日每公斤體重160mg，分3-4次靜脈滴注；腦脊膜炎：可增量至一日每公斤體重200mg，分3-4次靜脈滴注。在對家兔的血管刺激性試驗中，使用家兔9只，采用同體左右側(cè)自身對照。于家兔的左耳靜脈注射給予生理鹽水（9mg/ml），相同給藥容量供試品或上市品（20mg/ml）于家兔的右耳靜脈注射給予。每天給藥一次，連續(xù)給藥7天。于每天給藥前以及最后一次給藥后48小時進(jìn)行臨床觀察和給藥局部觀察，于給藥完成后48小時進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，按血管刺激實驗標(biāo)準(zhǔn)分級。試驗過程中，注射用鹽酸頭孢甲肟按臨床成人最大用藥

6、濃度給藥，每日1次兔耳緣靜脈注射，每次20mg/ml，連續(xù)7天，肉眼及組織學(xué)檢查相較生理鹽水組均未見異常，無刺激性。兩側(cè)對比無明顯差異。結(jié)果表明，注射用鹽酸頭孢甲肟采用20mg/ml濃度靜脈注射對家兔耳緣靜脈無刺激作用。家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗中，設(shè)置5個供試品組及陽性和陰性對照組。開始時每隔15分鐘觀察一次，1小時后，每隔1小時觀察一次，觀察3小時，觀察紅細(xì)胞溶解及凝聚情況。試驗過程中，陰性對照管無溶血和凝聚發(fā)生，陽性對照管有溶血發(fā)生，供試品組管中的溶液在3小時內(nèi)未發(fā)生溶血和凝聚，紅細(xì)胞形態(tài)正常。結(jié)果表明，注射用鹽酸頭孢甲肟在本試驗條件下不產(chǎn)生溶血或紅細(xì)胞聚集作用。本試驗根據(jù)化學(xué)藥物刺激性、過

7、敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則的要求，進(jìn)行了注射用鹽酸頭孢甲肟特殊安全性試驗，供臨床參考。1注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔的血管刺激性試驗1.1 樣品制備供試品為重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的注射用鹽酸頭孢甲肟（批號100801），對照上市品為Takeda Phamaceutical Company Lmited, Hikan Plant.生產(chǎn)(批號：HK566；進(jìn)口藥品注冊號：H20090190)。分別用0.9%氯化鈉注射液配制成20 mg/mL的溶液。陰性對照品0.9%氯化鈉注射液，由西南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號 11111019）。1.2 動物準(zhǔn)備日本大耳白兔，體重2-2.5 kg，購于第三軍醫(yī)

8、大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心動物房。生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2007-015，使用許可證號：SYXK（軍）2007-037。試驗前于動物房飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。1.3 實驗步驟給藥：供試品組使用家兔6只，于家兔的左耳靜脈注射給予生理鹽水，相同給藥容量供試品（20mg/ml）于家兔的右耳靜脈注射給予。上市品組使用家兔3只，給藥劑量同供試品組。供試品及上市品組給藥容積均為5mL /kg。用6號頭皮針于耳緣靜脈注射給藥，針尖穿刺血管的方向為由遠(yuǎn)心端至近心端，給藥速度為2-3mL/分鐘。每天給藥一次，連續(xù)給藥7天。觀察：于每天給藥前以及最后一次給藥后48h對動物和注射部位進(jìn)行肉眼

9、觀察，于給藥完成后48小時行病理組織學(xué)檢查，按血管刺激實驗標(biāo)準(zhǔn)分級。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。1.4 結(jié)果各組每次給藥前以及末次給藥后48 h，肉眼觀察注射部位，實驗側(cè)（右側(cè)）僅見血管輕度擴(kuò)張，無明顯充血、淤血，紋路清晰，周圍組織無水腫，與生理鹽水側(cè)（左側(cè)）比較無差別，記分為零。換算成相應(yīng)的反應(yīng)級分值見表2。單次觀察累計得分為0，無刺激性（圖1）。表1. 血管刺激試驗記分觀察方法血管刺激性評分標(biāo)準(zhǔn)血管刺激性判斷標(biāo)準(zhǔn)觀察指標(biāo)評分標(biāo)準(zhǔn)得分累計得分判斷標(biāo)準(zhǔn)肉 眼血管正常00.5無刺激性血管輕度充血發(fā)紅，紋路清晰1血管充血發(fā)紅，紋路不清晰22.5輕度刺激性血管重度充血，呈紫紅色3周圍組織無水腫04.5中度刺激性

10、輕微水腫1明顯水腫24.5重度刺激性重度水腫3光 鏡血管內(nèi)皮及血管壁完整00.5無刺激性內(nèi)皮損傷1血管栓塞22.5輕度刺激性血管破裂3周圍組織正常04.5中度刺激性水腫1出血24.5重度刺激性炎癥細(xì)胞浸潤3 表2 血管刺激試驗肉眼觀察記分表分組兔號1st2nd3rd4th5th6th7th7th后48h右左右左右左右左右左右左右左右左供試品組血管100000000000000002000000000000000030000000000000000400000000000000005000000000000000060000000000000000周圍組織10000000000000000200

11、0000000000000030000000000000000400000000000000005000000000000000060000000000000000上市品組血管100000000000000002000000000000000030000000000000000周圍組織100000000000000002000000000000000030000000000000000（右側(cè)為實驗側(cè)，左側(cè)為生理鹽水） 圖1. 7th后48h兔耳照片（均為供試品組）注射7天結(jié)束后48h，試供品組取三只兔，左右耳各取1cm長一段血管連同周圍組織行病理檢查；上市品組取兩只兔，左右耳各取1cm長一段血

12、管連同周圍組織行病理檢查。其余兔繼續(xù)飼養(yǎng)14天后取血管連同周圍組織行病理檢查。觀察結(jié)果：供試品組：實驗側(cè)與對照側(cè)組均顯示血管無充血，血管內(nèi)皮完整，無血栓形成，無炎性細(xì)胞浸潤，血管周圍組織無明顯改變（圖2）；上市品組：實驗側(cè)與對照側(cè)組均顯示血管無充血，血管內(nèi)皮完整，無血栓形成，無炎性細(xì)胞浸潤，血管周圍組織無明顯改變（圖3）；換算成相應(yīng)的反應(yīng)級分值（見表3），供試品組與上市品累計得分均為0，無刺激性。1.5 結(jié)果判斷注射用鹽酸頭孢甲肟（批號100801）按臨床成人最大用藥劑量給藥，每日1次兔耳緣靜脈注射，每次5ml/kg ( 20mg/ml )，連續(xù)7天，肉眼及組織學(xué)檢查相較生理鹽水組均未見異常，

13、無刺激性。兩側(cè)對比無明顯差異。表明注射用鹽酸頭孢甲肟采用20mg/ml濃度靜脈注射對家兔耳緣靜脈無刺激作用。圖2 兔耳緣靜脈血管刺激試驗組織學(xué)切片左為供試品，右為生理鹽水圖3 兔耳緣靜脈血管刺激試驗組織學(xué)切片左為上市品，右為生理鹽水 表3 血管刺激試驗病理觀察記分表分組兔號右（實驗側(cè)）左（生理鹽水側(cè)）供試品組血管100200300400500600周圍組織100200300400500600上市品組血管100200300周圍組織1002003002注射用鹽酸頭孢甲肟對家兔紅細(xì)胞體外溶血試驗2.1 樣品準(zhǔn)備供試品為重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的注射用鹽酸頭孢甲肟（批號100801），對照上市品

14、為Takeda Phamaceutical Company Lmited, Hikan Plant.生產(chǎn)(批號：HK566；進(jìn)口藥品注冊號：H20090190)。供試品與上市品分別用0.9%氯化鈉注射液配制成20 mg/mL的溶液。陽性對照品為高壓去離子水（實驗室自備）。陰性對照品0.9%氯化鈉注射液，由西南藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號 11111019）。2.2 動物準(zhǔn)備日本大耳白兔，體重1.5-2kg，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心動物房。生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2007-015，使用許可證號：SYXK（軍）2007-037。試驗前于動物房飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。2

15、.3 實驗步驟2% 紅細(xì)胞混懸液的制備：固定家兔，心臟取兔血約8毫升，放入三角瓶中，用玻璃棒攪動血液約10分鐘，以除去纖維蛋白、使成脫纖血液。加10倍的生理鹽水，搖勻，1500 rpm/min，離心10分鐘，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水如法洗滌6次，至上清液不顯紅色為止。取所得紅細(xì)胞1ml，用生理鹽水按體積比配成2%的懸液，紅細(xì)胞懸液50ml，供試驗用。試驗方法：取潔凈試管7支編號，15號為供試品管或上市品管，6管為陰性對照管，7管為陽性對照管。按下表所示向各試管依次加入2% 紅細(xì)胞懸液、0.9% 氯化鈉注射液、供試品溶液或高壓去離子水，混勻后，放置于37±0.5恒溫箱中溫育

16、。開始時每隔15分鐘觀察一次，1小時后，每隔1小時觀察一次，觀察3小時，如溶液呈透明紅色，即表示溶血；如溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，表示有紅細(xì)胞凝聚作用。試管編號12345672%紅細(xì)胞混懸液（mL）2.52.52.52.52.52.52.50.9%氯化鈉注射液（mL）2.02.12.22.32.42.5供試品或上市品（mL）0.50.40.30.20.1高壓去離子水（mL）2.5觀察：完全溶血溶液澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留。部分溶血溶液澄明紅色或棕色，管底有少量紅細(xì)胞殘留。無 溶 血紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無色澄明。凝 聚雖不溶血，溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明有紅細(xì)胞凝聚。應(yīng)進(jìn)一步判斷是真凝聚還是假凝聚，凝聚物振搖后均勻分散，將凝聚物取出置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在蓋玻片邊緣滴2滴生理鹽水，在顯微鏡下觀察，凝聚的紅細(xì)胞能被沖散者為假凝聚。若凝聚物不被搖散或在玻片上不被沖散者為真凝聚。2.4 結(jié)果0、15、30、45、60、120、180 min后，供試品組及上市品組試管中紅細(xì)胞隨著時間增加而逐漸下沉，上層液體無色澄明，亦未見紅細(xì)胞凝集（左圖為試供品，右圖為上市品）。陰性對照管無溶血和凝聚發(fā)生，陽性對照管溶液澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留，為全溶血。 供試品 1h