表皮生長因子mRNA在先天性腎積水患腎中的表達

1、    表皮生長因子mRNA 在先天性 腎積水患腎中的表達        【摘要】目的檢測先天性腎積水患兒患腎組織表皮生 長因子(EG F)mRNA 表達的改變，探討EGF在小兒先天性腎積水腎損傷中的作用。方法采用RT-PCR技術(shù)檢測17例先天性腎積水患兒患腎實質(zhì)組織，7例腎盂組織, 7例腎 盂 輸尿管狹窄(PUJ)組織中EGF mRNA的表達，經(jīng)凝膠分析系統(tǒng)半定量，和正常腎、腎盂及輸尿 管對照。結(jié)果患腎組織及PUJ中EGF mRNA表達較正常腎組織下降

2、，腎盂組織表達也較對照組低，但差異無顯著性。在患腎實質(zhì)組織中EGF mRNA 的表 達下降最顯著。結(jié)論先天性腎積水患兒患腎組織EGF表達下降， EGF表達減少和先天性腎積水所致的慢性腎損傷及腎萎縮相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】腎畸形腎積水 Expression of EGF mRNA in renal parenchyma of congenital hydronephros is in childrenYANG Yi，JI Shijun，GAO Hong, et al.Department of Pe diatric Surgery, the Second Clinical Hospital, China

3、 Medical University,Shenyang 110003,China【Abstract】ObjectiveTo detect the expression of EGF m RNA in renal parenchyma in congenital hydronephrosis in children and to evaluate the role of EGF in causing chronic renal damage.MethodsThe expression of EGF mRNA in renal parenchyma, renal pelvis and PUJ t

4、issues f rom congenital hydronephrosis in children was studied by means of RT-PCR.ResultsThe expression of EGF in the aff-ected renal par enchyma and PUJ tissues decreased.It also decreased in the affected pelvis but the difference was not significant. The decrease of EGF expression was the most obv

5、ious in the affected renal parenchyma.ConclusionsE GF expression decreased in renal parenchyma in congenital hydronephrosis and the decrease might be related to the chronic renal damage and renal atrophy caused by hydronephrosis.【Key words】KidneyAbnormalitiesHydronephrosis我們檢測了先天性腎積水患兒患腎表皮生長因子(EGF)

6、mRNA 表達的改變，探討先天性腎積 水患兒患腎病理改變的發(fā)生機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。資料與方法一、標本來源先天性腎積水患兒患腎組織17例，正常腎組織4例，7例患兒腎盂組織,3例正常腎盂 組織；7例腎盂輸尿管狹窄段（PUJ）組織，3例正常輸尿管組織。液氮中速凍后-76冰箱中 保存。二、RNA 提取將標本剪碎后，加入1ml TRIZOL Reagent勻漿，抽吸成乳糜狀，再用氯仿、異丙醇、酒精等 處理，提取標本中的總RNA。在紫外分光光度計下測得吸光度A260和A28 0值，計算提取物濃度，2%瓊脂 糖凝膠電泳觀察RNA，總RNA經(jīng)定量后用DEPC（焦碳酸二乙脂）溶解成1mg/ml的溶液。

7、三、cDNA合成將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴增儀為PTC-100TM型。采用20l反應體系，反 應條件：65 1min，30 5min，3560于18min中內(nèi)勻速升溫，65 30min，985min ，55min。四、PCR擴增cDNA因三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)表達恒定，不隨實驗操作和環(huán)境條件變化而變化，故取等量 的總 RNA同時進行EGF 和GAPDH的RT-PCR擴增，可顯示每一個總RNA標本提取的完整性和擴增過程 的可靠性，并可半定量分析。采用50l擴增體系，反應條件：94預變性4min，95變性1 min、55退火1min、72延伸2min，循環(huán)30次，最后

8、72延伸10min。EGF引物序列:上游:5-CAGGTAATGGAGCGAAGCTTTCAT-3；下游:5-GAGTTAAATGCCTACACTGTATCT-3；擴增片段：624bp；內(nèi)參照：GAPDH引物序列：上游:5-GAGCCTGAGGCCGACTACTA-3；下游:5-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3；擴增片段：528bp。提取RNA的試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴增試劑盒均購于大連寶生物公司， EGF RT-PCR 引物購于深圳晶美生物工程有限公司。五、PCR產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳， Marker為X174-Hinc（大連寶生 物公司）。電泳結(jié)果照相并

9、存入Kodak Science ID 凝膠分析系統(tǒng)，以GAPDH吸光度A值 標化EGF的吸光度A值，得到EGF的相對含量。結(jié)果一、總RNA的純度經(jīng)紫外分光光度計測定提取的總RNA A260/A280值為1.61.9，說明 提取的總R NA純度良好。內(nèi)參照GAPDH在各反應體系中擴增結(jié)果基本一致，證實PCR反應基本真實反應了 EGF在先天性腎積水患腎中的表達。二、EGF mRNA 在先天性腎積水患兒患腎組織中的表達17例先天性腎積水患兒患腎中檢測的EGF mRNA表達和正常對照腎相比明顯降低，4例 正常腎可見較強的電泳帶，而患腎僅3例有弱的電泳帶顯示，余均為陰性(1)。三、EGF mRNA在患腎

10、腎盂組織中的表達3例正常和7例患腎腎盂中EGF mRNA擴增產(chǎn)物均有特異片段的電泳帶顯示（2）。半定量 分析 表明：正常腎EGF/GAPDH比值平均為1.135,而患腎EGF/GAPDH比值平均為0.302,但二者之間差 異無顯著性，P=0.2931。四、EGF mRNA在患腎PUJ組織中的表達正常腎EGF mRNA擴增產(chǎn)物顯示較強的特異擴增帶，而在患兒組有2例電泳帶較強,同正 常組；余5例較弱或為陰性（3）。     1EGF mRNA在患腎中的表達117為患腎，5、13、17可 見微弱的擴增帶，余為陰性，N1-N4為正常腎，可見明顯的擴增帶 

11、;    2EGF mRNA在患腎腎盂中的表達17為患腎腎盂，N1-N3為正常腎盂，均可見擴增帶     3EGF mRNA在患腎PUJ狹窄段中的表達17為患腎狹窄段，4和5擴增帶較強，2、6、7可見較弱的擴增帶，1、3為陰性，N1-N3為 正常輸尿管，均有明顯的擴增帶本組對3例患兒分別檢測了患腎、腎盂及PUJ EGF mRNA的表達，結(jié)果示患腎缺失EGF擴增 條帶，而腎盂和PUJ均可見特異擴增條帶。討論EGF系多肽生長因子，由53個氨基酸組成，作為具有生物學活性的跨膜蛋白的大 分子前體而發(fā)揮作用。研究表明，EGF可影響腎

12、臟代謝，促進靶細胞增殖，EGF還是遠端腎單位、輸尿管和膀胱上皮的保護因子，對維持泌 尿系上皮細胞的完整性起重要作用，此外EGF還可促進胚胎腎細胞增殖1。動 物實驗研究示EGF在急性腎損傷后的細胞增殖和分化調(diào)節(jié)方面起重要作用。對急性輸尿管 梗阻所致腎積水的動物模型研究也表明單側(cè)完全輸尿管梗阻的患腎中EGF表達 下降2。Kennedy等3 還發(fā)現(xiàn)，給單側(cè)輸尿管完全結(jié)扎的鼠模型皮下注 射重組EGF，可促進腎小管上皮細胞再生并且使凋亡下降50%。本研究顯示，患腎EGF mRNA 的表達較正常組顯著下降，在正常對照腎均 可見較強的電泳帶，而僅3例患腎有較弱的電泳帶顯示。本組患兒均為中、重度腎積水，均 已

13、出現(xiàn)明顯的腎萎縮，而3例有較弱電泳帶的患兒腎積水及腎臟萎縮程度均比其他患兒輕。 提示EGF表達減少和先天性腎積水所致的慢性腎損傷及腎萎縮相關(guān)。本研究 還發(fā)現(xiàn)EGF mRNA在患腎腎盂中的表達較對照組低，但差異無顯著性；在腎盂輸尿管連接處 狹窄段中的表達也較對照組降低，提示EGF表達下降和腎積水腎盂的肥厚及狹窄段平滑 肌肥厚、纖維組織增生有一定關(guān)系。對于導致EGF變化的具體發(fā)生機制還不十分清楚。一些研究表明培養(yǎng)的腎小管細胞能合成或 分泌刺激細胞增殖的多肽，而腎小管損傷可導致這些多肽的上調(diào)或下調(diào)。有學者推測輸尿管 梗 阻后使腎小管上皮化學吸引劑表達上調(diào)的機械因素有二個：首先，腎小管壓力升高或膜的牽

14、 拉可 能引起腎小管細胞釋放化學吸引劑；另一個因素是腎缺血，有研究表明在慢性輕度缺血所致 的腎疾病中，細胞凋亡對發(fā)生腎萎縮起了很重要的作用，EGF表達下降被認為是啟動凋亡的 一個因素4。在鼠體內(nèi)應用EGF可促進腎小管細胞增生，并可加速急性腎損傷腎功能的恢復。研究表 明，在梗阻初期，皮下注射EGF可致核DNA的保存，抑制和凋亡相關(guān)的基因活性，增加腎皮質(zhì) 有絲分裂活性。EGF作用于腎細胞，使其結(jié)束細胞周期的G0期，促其進入活動 的細胞復制（有絲分裂）周期。因此，對于EGF在先天性腎積水患腎中的表達及其機 制的進一步研究，可對腎損傷的修復和腎臟纖維化的逆轉(zhuǎn)提供一定的理論依據(jù)。作者單位：楊屹(1100

15、03 沈陽，中國醫(yī)科大學第二臨床學院小兒外科)吉士俊(110003 沈陽，中國醫(yī)科大學第二臨床學院小兒外科)趙國貴(110003 沈陽，中國醫(yī)科大學第二臨床學院小兒外科)王常林(110003 沈陽，中國醫(yī)科大學第二臨床學院小兒外科)侯英(110003 沈陽，中國醫(yī)科大學第二臨床學院小兒外科)高紅(衛(wèi)生部小兒先天畸形重點實驗室)參考文獻1，Gesualdo L, Paolo SD, Calabro A, et al. Expression of epidermal growt h factor and its receptor in normal and diseased human kidne

16、y: An immunohistoche mical and in situ hydridization study. Kid Int, 1996,49656-665.2，Walton G, Buttyan R, GarciA-Montes E, et al. Renal growth factor expression during the early phase of experimental hydronephrosis. J Urol, 1992, 148510-5 14.3，Kennedy WA, Buttyan R, Garcia-Montes E, et al. Epidermal growth fa