質(zhì)粒抽提詳細(xì)步驟

1、質(zhì)粒提取實驗步驟搖菌：（先倒入錐形瓶再消毒）1將配好的LB培養(yǎng)液高溫消毒后，放入4°C冰箱，冷卻；2在酒精燈旁操作，向錐形瓶中加入lOOmILB，加入150ul氨芐（看抗性）；3再向錐形瓶中挑入少量菌（液體：6080ul;固體：綠豆大?。?放入搖床，搖一夜。LB培養(yǎng)液的配方1） 胰化蛋白胨 （）10g/L（trypto ne）2） 酵母提取物5g/L （ yeast extract）3）Nacl 10g/L4）去離子水（雙蒸水） 950ml * 終體積為1000ml5） 配好后，需高溫消毒（紗布或報紙包）質(zhì)粒提取:QIAGEN plasmid Midi kit（ 25）試劑盒準(zhǔn)備2

2、個50mlEP管，提2個質(zhì)粒一共要 6個50mlEP管。使用前注意事項：1） P1在使用前要加入 RNAase，終濃度為 100ug/ml，P1 一直放4°C。2） 事先溶解P2 （天冷時P2會出現(xiàn)沉淀，應(yīng)放 37 °C水浴溶解）。3） 預(yù)冷至P1、P3（ P2作用為裂解細(xì)胞）至 4 °C。4）提質(zhì)粒前一天消毒 50ml，20ml管子及2mlEP管及LB，干燥待用。5）搖菌和保菌都要開酒精燈，盡量保持無菌，用酒精燈擦桌子和瓶口，不能講話或者戴口 罩。步驟:1搖菌100ml過夜（100ml菌分兩次離心，錐形瓶中剩余的菌留作保菌用）；2酒精燈旁操作，倒入 50ml管子

3、，6000g、15min （離心力/RCF ）、40C （配平及記得更換轉(zhuǎn) 子/Rootor），離心完后棄去上清收集細(xì)菌；3用3ml P1重懸細(xì)菌沉淀物（充分溶解，沉淀可通過槍反復(fù)上下吸打混勻）分兩管離心，各加3ml P1，后再混合為一管，保證100ml菌液用了 3ml P1重懸。4加3ml P2（ P2比較粘稠，用之前要晃勻），充分混勻到整個液體都變藍(lán)（上下輕柔顛倒 46次），室溫放置5min （混勻時不可過猛，以免弄斷genemic DNA ;裂解物是粘性的，溶解時間切勿超過5min，旦加入P2就應(yīng)立即將管子蓋上，以防酸化）；5加入預(yù)冷的P3 3ml，立即溫和的混勻至藍(lán)色消失（上下輕柔顛倒

4、46次），放置冰上避光孵育1520分鐘加入P3后，產(chǎn)生蓬松白色物質(zhì)，沉淀物變得不粘（沉淀物包括genemicDNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片、SDS）；6 4 0C、20000g、30min離心，將上清液放入另一10ml的EP管（注意移動時不能晃，以免將沉淀轉(zhuǎn)入），直接在離心室加，加完一個扔一個，注意一點沉淀都不能吸進(jìn)去，吸時用雙槍頭，黃槍頭套在藍(lán)槍頭外，減少沖擊；7離心同時，用 4mlQBT潤洗QIAGEN-tip100 （平衡膜），棄去脫下上液；8用2 X 10mlQC洗QIAGEN-tip100兩次，棄去滴下的液體（注意濾膜不要干燥，管中液體 滿了就棄去，液面不要觸及TIP下部，如果觸及則用雙蒸

5、水沖洗），加入離心后并經(jīng)過萃取的上清液，萃取步驟如下圖;離心后把上清液吸到干凈的50ml的EP管,兩管變一管，管蓋和管 壁上都標(biāo)記。加入等體積的氯仿上 下顛倒混勻（萃取提 純） 20000g、15min、4 °C離心 把離心后的上清液直接加到TIP中過濾（TIP標(biāo) 記）；9待液體差不多濾過時，用5ml的QF洗脫膜上的DNA，用10mlEP管收集洗脫物（最先流出來的34滴棄去），收集后混勻，可用搖床10min ;10每管用3.5ml的室溫異丙醇沉淀 DNA，混勻10min，然后4 °C、15000g、離心30min , 沉淀在管底的異丙醇沉淀物有玻璃樣外觀，非常松軟，棄去上清

6、時小心；11先加1ml的70%乙醇洗DNA沉淀，移入1.5ml的EP管（把沉淀打散后再移入，能不用 2mlEP盡量不用，TIP的架子要回收），15000g離心10分鐘，倒去上液，不要觸及沉淀，重 復(fù)洗一次（把沉淀吹打到液體中，輕柔） ；12空氣中干燥沉淀510分鐘，待干燥后（無色透明）用合適體積（ 50ul ）的AE溶解沉淀（56°c水浴10min，加快溶解），放入4 0C冰箱過夜；13第二天測濃度（DNA ）,稀釋到1ug/ul，待轉(zhuǎn)染用。提質(zhì)粒和保菌:1將搖菌過夜后變渾濁（培養(yǎng)基加入抗生素）的錐形瓶取出，分別裝到2個50ml的EP管中，離心4 0C、6000g、5min。把上清液倒掉，放入一 800C