基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定技術(shù)圖文百精

1、浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) A cta A gricult urae Zhejiangens is 22(6:727730, 2010基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定技術(shù)魯忠富 , 徐 沛 , 汪寶根 , 劉永華 , 吳曉花 , 胡婷婷 , 李國(guó)景*(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所 , 浙江 杭州 310021收稿日期 :2010-06-17基金項(xiàng)目 :浙江省科技廳重大優(yōu)先主題項(xiàng)目 (2008C120031 作者簡(jiǎn)介 :魯忠富 (1963-, 男 , 浙江杭州人 , 農(nóng)藝師 , 主要從事蔬 菜育種 和栽 培 技術(shù) 研究 工作。 E m ai:l l u zf zaas . org ; T e

2、:l 0571 86404223*通 訊 作 者 , 李 國(guó) 景 , E m a i :l Guoji ng _liyahoo . co m. cn; T el (摘 要 :當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的長(zhǎng)豇豆品種眾多 , 且商業(yè)品種間的遺傳相似性愈來(lái)愈高 , 種子質(zhì) 量糾紛時(shí) 有發(fā)生。 本研究以 44份核 心長(zhǎng)豇豆種質(zhì)為試材 , 利用普通豇豆 DNA 序列 信息 , 通過(guò) 生物信息 學(xué)方法自主 設(shè)計(jì)開發(fā)適 用于長(zhǎng)豇豆研究的 SS R 引物 , 從中篩選出 10對(duì) 診斷性引物 , 在此基礎(chǔ)上 建立基于 SSR 分子 標(biāo)記技 術(shù)的長(zhǎng)豇 豆種子純度快速檢測(cè)方 法 , 可滿足長(zhǎng)豇豆種子產(chǎn)業(yè)化的需要。 關(guān)鍵詞 :長(zhǎng)

3、豇豆 ; SSR; 純度鑒定 ; 遺傳指紋圖譜 中圖分類號(hào) :S 643 4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A文章編號(hào) :1004-1524(2010 06-0727-04A rapid and precise SSR based procedure for seed quality surveying of Vigna un guiculata ssp . sesqui p edalis (L . Verd .L U Zhong f u , XU Pe, i WANG Bao geng , LI U Yong hua , WU X iao hua , Hu T i n g ti n g , LI Guo j

4、i n g*(Instit ute of Vegetab les, Zhejiang A cade my of A gricult ural Sciences , H angzhou 310021, Chi naAbstrac t :Current applica tion of l a rge nu mber o f comm erc i a l asparagus bean culti va rs w it h v ery hi gh g enetic si m ilar i ty causedm ore andm o re d isputes on seed qua lity . In

5、t h is research , a set of SS R ma rkers for asparagus bean w ere de ve l oped based on a b i o i n f o r m ati cs based approach . T en o f t hese ma rkersw ere defi ned as diagnosti c m arkers by geno typ i ng a core co llecti on o f asparagus bean consisti ng of 44li nes . Based on t h is , a rap

6、 i d and prec i se SSR based proce dure f o r asparagus bean seed qua lity survey i ng w as estab lished , w hich wou l d m eet t he de m and o f rap i d l y deve l op i ng asparagus bean i ndustry .K ey word s :asparagus bean ; SS R; purity s urvey i ng ; genetic fi ngerpri nt長(zhǎng)豇 豆 (Vi g na unguicul

7、ata ssp . sesqui p edalis (L . V er d. 嫩莢供食 , 是 我國(guó)重要的夏季豆類 蔬菜之一。我國(guó)從事長(zhǎng)豇豆育種、 種子生產(chǎn)和經(jīng) 營(yíng)的科研院所、 企業(yè)眾多。當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用的長(zhǎng) 豇豆品種眾多 , 年用種量大 , 商業(yè)品種間的遺傳 相似性愈來(lái)愈高 , 同種異名、 同名異種現(xiàn)象日益 嚴(yán)重 , 種子質(zhì)量糾紛時(shí)有發(fā)生。目前我國(guó)蔬菜品 種真?zhèn)闻c純度鑒定大多依靠田間表現(xiàn)型鑒定 , 鑒定所需時(shí)間長(zhǎng) (一般需 5060d, 并受季節(jié)的限 制 , 而且作物的表現(xiàn)型易隨環(huán)境條件的變化而變 化 , 特別是對(duì)于一些形態(tài)差異較小的品種間鑒定 難度更 大。因此 , 很 有必要 研究 開發(fā) 一

8、種 能早 期、 周年、 快速、 準(zhǔn)確鑒定長(zhǎng)豇豆品種真?zhèn)魏图兌?的檢測(cè)方法。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已被用于鑒別 不同品種 之間在分子水平 上的差異1-3。由于在同一物種的各個(gè)品種間存 在有大量的多態(tài)性 標(biāo)記 , 每一品種均存在有區(qū)別于其他品種的獨(dú)特 標(biāo)記 , 即一些特異性 DNA 片段 , 稱為該品種的指 紋 , 各品種獨(dú) 特的指紋 片段組合 構(gòu)成該物 種的 DNA 指紋圖譜。與傳統(tǒng)的依據(jù)表型性狀鑒定相 比 ,以在植株生長(zhǎng)的 任何階段進(jìn)行 , 鑒定快速 , 并不 受基因表達(dá)和環(huán)境條件的影響等優(yōu)點(diǎn)。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)利用 真核生物基 因組中 存在的大量微衛(wèi)星重復(fù)序列設(shè)計(jì)引物 , 通過(guò) PC

9、R 擴(kuò)增串聯(lián)的重復(fù)序列 , 并依據(jù)微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù) 在同一物種不同基因型間 的差異揭示長(zhǎng)度多態(tài) 性 4。 SSR 由于分布廣、 穩(wěn)定性和多態(tài)率高 , 操 作簡(jiǎn)單、 重復(fù)性好、 對(duì) DNA 質(zhì)量要求較低 等 , 被 譽(yù)為第二代分子標(biāo) 記的明星。 SSR 分 子標(biāo)記技 術(shù)克服了 RAPD 穩(wěn)定性和 重復(fù)性差 , AFLP 技術(shù) 費(fèi)用昂貴、 操作復(fù)雜、 對(duì) DNA 的純度和內(nèi)切酶的 質(zhì)量要 求很 高等缺 點(diǎn)。為此 , 本 研究 建立 基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的種子純度快速檢測(cè)方法 , 現(xiàn) 將結(jié)果報(bào)道如下。1 材料與方法1. 1 材料供試材料由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬 菜研究所 提供 , 共 44份 ,

10、包括我國(guó)當(dāng)前生 產(chǎn)上主栽品種、 代表不同地域分布和具有 植物學(xué)多態(tài)性的材料 37份 , 來(lái)自美國(guó)和非洲的材料 7份。 SSR 反應(yīng)用 試劑 , T ris 、 硝酸銀、 尿素等生化試劑購(gòu)自北京鼎 國(guó)生物技術(shù)有限公司 , E co R , M se 內(nèi)切酶購(gòu)自 上海生物工程技術(shù)有限公司 , Taq 酶、 dNTP 等購(gòu) 自 Pro m ega 公司。1. 2 方法1. 2 1 豇豆 DNA 數(shù)據(jù)庫(kù) 的下載 、 序 列處 理和 SSR 引物設(shè)計(jì)從 CGKB 數(shù) 據(jù) 庫(kù) (http :/co w peageno m ics . m ed . v irg i n ia . edu /CGKB/下載豇豆

11、基因組序列 , 從 H ar vEST 數(shù)據(jù)庫(kù) (http :/harves.t ucr . edu /下 載長(zhǎng)豇 豆 EST 序 列 ; 運(yùn) 行 V ecScreen 程 序 (ht tp :/www. ncb. i n l m . n i h . gov 去除下載序列上包 含的載體和接頭序列。運(yùn) 行 CAP3程 序 (http :/genom e . cs . m tu . edu /sas. ht m l 對(duì)所得 序列進(jìn)行序列拼 接以去除 重復(fù) , 獲得無(wú)冗余的 DNA 序列 ; 運(yùn)行 H ornb ill 程 序 (h ttp :/hornbil. l cspp . latrobe .

12、 edu . au /cg i bin pub /ssrpri m er/index ssr . pl 鑒定 DNA 序列上所包 含的 SSR 位點(diǎn)并設(shè)計(jì)出 SSR 引物 100對(duì) ; 交由上 1. 2 2 基因組 DNA 的提取將豇豆種子散播于裝有基質(zhì) (蛭石 泥炭 =1 2 的育苗穴盤中 , 置于 2530! 下育苗 , 待第一 對(duì)真葉 平展時(shí) , 取葉 片 0 1g , 加液 氮研磨 成粉 末 , 參照 M urry 和 Thos m pon 等 5的 C TAB 法提取 DNA 。1. 2 3 SSR 引物擴(kuò)增和電泳檢測(cè)PCR 分析反應(yīng)體積為 12 5 L , 各組分為 10 buff

13、er 1 25 L , 25mm ol/LMgC l 20 75 L, 2 5 mm o l/Ld NTPs 1 L, Taq 酶 (5U / L 0 1 L , 模板 DNA 10ng , 加水至 12 5 L 。 SSR 反應(yīng)程序 為 :94! 預(yù)變性 3m i n , 94! 變性 30s , 52! 退火 30s , 72! 延伸 50s , 循環(huán) 35次 , 最后 72! 延伸 5 m in 。在 PTC 225擴(kuò)增儀上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 , 擴(kuò)增 產(chǎn)物在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分 離 , 銀染顯色 6, 7。2 結(jié)果與分析2. 1 SSR 引物 多態(tài)性 信息 含量 計(jì)算

14、 和診 斷性 SSR 引物篩選提 取 44份 有 代 表 性的 長(zhǎng) 豇 豆 基 因 組 總 DNA, 經(jīng)檢測(cè) 其 DNA 質(zhì)量符合 研究所需。用設(shè) 計(jì)合成的 100對(duì) SSR 引物分 別擴(kuò)增這些材料的 DNA, PCR 反 應(yīng) 體 積 為 12 5 L , 退 火 溫 度 為 52! 。經(jīng)對(duì)每對(duì)引物的擴(kuò)增情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì) , 并對(duì) 擴(kuò)增條帶進(jìn)行 0或 1賦值 , 計(jì)算各引物的多態(tài)性 信息含量。從這 100對(duì) SSR 引物擴(kuò)增條帶的穩(wěn) 定性、 引物多態(tài)性指數(shù)和多態(tài)性條帶的易分辨程 度 3方 面 進(jìn) 行 綜 合 評(píng) 價(jià) , 從 中 選 取 CPL031, CPL053, CPL078, CPL112,

15、 CPL114, CPL135, CPL333, CPL420, CPL840, CPL865共 10對(duì)引 物 作為診斷性引物組合 , 如表 1。2. 2 我國(guó) 5個(gè)長(zhǎng)豇豆主栽品種標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的 構(gòu)建用上述 10對(duì)診斷性 SSR 引物分別擴(kuò)增 #之 豇 106 、 #揚(yáng)早豇 1號(hào) 、 #之豇特早 30 、 #寧豇 3號(hào) 及 #黑眉 等 5個(gè)我國(guó)當(dāng)前生產(chǎn)上長(zhǎng)豇豆主栽 品種的 DNA, 將擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為 8%的非變性 聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離 , 銀染照相并記 錄結(jié)果 , 經(jīng) Pho toshop 軟件處理后獲 得主栽品種%728%浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 第 22卷 第 6期 (2010年 11月 由

16、圖 1可見 , 用以上 10對(duì)診斷性 SSR 引物 組合構(gòu)建的 5個(gè)我國(guó)當(dāng)前 生產(chǎn)上長(zhǎng)豇豆主栽品種的 DNA 指紋圖譜條帶清晰 , 每對(duì)引物 組合擴(kuò) 增 的條帶數(shù)不同 , 在 112條 之間 ; 不 同品種擴(kuò)表 1 十對(duì)長(zhǎng)豇豆診斷性 SS R 引物組合Table 1 Ten d i agnosti c SSR prm i er comb i nati ons for as paragus bean序號(hào) 引物名稱 正向序列 (5 -3 反向序列 (5 -3 1CPL031CGCTCTTCGTTGATGGTTATG GTGTTCTAGAGGGTGTGATGGTA 2CPL053ACAGGTTCCT

17、TGTGAAGCAC GCCATACGCAACTCAGCTAT 3CPL078GAACAGCTTCCTGAACCTCA GCTTTCATCTGCTCCAGGTA 4CPL112AACCCAGCATACCTGCATAA CTCGCCAATGATTCTGAGAT 5CPL114AATGTTTGGACTGGTCAGGA GAGGACAAGTCAGGAAGCAA 6CPL135GGTGGAAATCAGGTTGTTTG AGCCAATTGTCAAGTTCAGC 7CPL333TCGATCAAATTTTCCTCTGC TGCCACCATCTTTCATTTCT 8CPL420CGCGTACAACATCTCT

18、TCCT GTGCCAATGGATCAGGTAAC 9CPL840TAGCATAGAAGAAGCAATCGT CTGGAATCTGGAAGGAGAA 10CPL865CTCTCTCTCTCCACATCTCAA CATCATCAATCACACAACTTCM. DNA M aeker ; 1. CPL112; 2. CPL053; 3. CPL114; 4. CPL031; 5. CPL135; 6. CPL840; 7. CPL420; 8. CPL865; 9. CPL078; 10. CPL333; 箭頭示各品種 DNA 指紋的主要差異之處圖 1 我國(guó) 5個(gè)長(zhǎng)豇豆主栽品種的標(biāo)準(zhǔn) DNA 指紋

19、 圖譜F ig . 1The standard DNA fi ngerpr i nts o f 5m a i n cu lti vars o f asparagus bean i n China%729%魯忠富等 :基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定技術(shù)增出的條帶數(shù)差異性大 , 特別是 #黑眉 與其他 4品種間差異大 ; 不同品種間差異 性條帶數(shù)不同 , #之豇 106 與 #揚(yáng)早豇 1號(hào) 之間差異條帶數(shù)在13條以上 , 完全可滿足區(qū)分不同品種的要求。2. 3 基于 SSR 分子標(biāo)記技術(shù)的豇豆種子純度快 速檢測(cè)方法利用以上研究開發(fā)出的診斷性 SSR 引物進(jìn) 行長(zhǎng)豇豆種子純度檢測(cè)

20、 , 其主要步驟包括 :&DNA 提取 :將待檢種子散播于 裝有基質(zhì) V (蛭石 V (泥炭 =12的育苗穴盤中 , 置于 25 30! 下育苗 , 待第一對(duì)真葉平展時(shí) , 單株取葉 片 0 1g , 加液氮研磨成粉末 , 用常規(guī) CTAB 法提 取 DNA 。 SSR 引物擴(kuò)增 :用上述 10對(duì)診斷性 SSR 引物進(jìn)行 PCR 分析 , 反應(yīng)體 積為 12 5 L , PC R 反應(yīng)程 序同上。 (電泳檢 測(cè) :將擴(kuò) 增產(chǎn)物 在 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離 , 然后進(jìn)行銀染顯 色 , 數(shù)碼相機(jī)照相記錄結(jié) 果 , 獲 得待檢材料的 DNA 指紋圖譜。 DNA 指紋圖 譜比對(duì)

21、 :將待檢材料的 DNA 指紋圖譜 與該品種 標(biāo)準(zhǔn) DNA 指紋圖譜進(jìn)行 比對(duì) , 如兩者 的指紋圖 譜完全相吻合 , 則該待檢材料為真種子 , 否則為 偽種子。對(duì)于沒有標(biāo)準(zhǔn)圖譜的品種 , 按同樣方法 先建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜。 種子純度計(jì)算 :種子純度 =(檢測(cè)所得真種子數(shù) /檢 測(cè)種子 總數(shù) 100%3 討論本研究的特點(diǎn) :(1 應(yīng)用自主開發(fā)和篩選出的 10對(duì)診斷性 SSR 引物組合 , 增強(qiáng)了鑒別近似品種的能力。經(jīng) 過(guò)理論計(jì)算、 近似品種擴(kuò)增比較 (圖 1 及大量檢 測(cè)實(shí)踐證明這套引物能有 效區(qū)分長(zhǎng)豇豆不同基 因型 , 完全可以滿足對(duì)當(dāng)前生產(chǎn)上主要長(zhǎng)豇豆品 種進(jìn)行真?zhèn)螜z測(cè)的需要。(2 直接鑒定遺傳

22、物質(zhì) , 大大提高了鑒定的 準(zhǔn)確性。本研究使種子純度的鑒定在 DNA 水平 上進(jìn)行 , 避免了表型鑒定、 生化 鑒定等間接鑒定 方法所可能帶來(lái)的誤差 , 有操作方便 , 重復(fù)性好 的特點(diǎn) , 具有高度的可靠性和權(quán)威性。(3 提 高了檢測(cè)的效率和標(biāo)準(zhǔn)化程度。利 用本技術(shù)進(jìn)行種 子純度檢測(cè) , 其結(jié)果穩(wěn) 定可靠 , 易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化 , 檢測(cè)時(shí)間僅需 45h , 一次可 對(duì)多達(dá)上百份樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。一般種子質(zhì) 檢室只需具備常規(guī)的分子生 物學(xué)設(shè)備就可按提 供的操作 程序進(jìn)行 實(shí)際檢測(cè) , PCR 反應(yīng)各 組分 (MgC l 2, Bu ffer , d NTP , Taq 酶 購(gòu)置方便 , 檢測(cè)成 本低廉 , 僅為傳統(tǒng)表型鑒定的六分之一左右。認(rèn) 為該技術(shù)完全可用于生產(chǎn)上 種子純度快速鑒定 的需要。參考文獻(xiàn) :1 王玲平 , 戴丹麗 , 吳曉花 , 等 . AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)在浙蒲 2號(hào)種子純度快速鑒定中的應(yīng)用 J.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) , 2008, 20(2:84-87.2 翟文強(qiáng) , 田清 震 , 賈繼增 , 等 . 哈密瓜雜交 種純度的 AFLP 指紋鑒定 J.園藝學(xué)報(bào) , 2002,