轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測

1、 轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗方法Food safety detection of genetically modified organisms and derived productsMethod of target protein digestive stability in simulative gastric and intestinal fluid(報批稿)××××-××-××發(fā)布 ××××-××-×

2、×實施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 發(fā)布前 言本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部科技教育司提出。本標準歸口全國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理標準化技術(shù)委員會。本標準起草單位：農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心、中國農(nóng)業(yè)大學。本標準主要起草人：黃昆侖、唐茂芝、段武德、羅云波、賀曉云、劉信、宋貴文、沈平、許文濤、厲建盟。本標準為首次發(fā)布。轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全檢測模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗方法1 范圍本標準規(guī)定了外源蛋白質(zhì)在模擬胃液和模擬腸液消化穩(wěn)定性的檢測方法。本標準適用于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品中外源基因表達蛋白質(zhì)或者用微生物表達的與植物中的外源蛋白具有實質(zhì)等同性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在模擬胃液和模擬腸液消化條件下穩(wěn)定性的檢

3、測。2 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。外源蛋白質(zhì) exogenous protein 從轉(zhuǎn)基因生物中提取的通過基因工程手段轉(zhuǎn)入生物中的外源基因所表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或者將轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因轉(zhuǎn)入微生物中所表達的與植物中的外源蛋白質(zhì)具有實質(zhì)等同性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。2.2 模擬胃消化液 stimulated gastric fluid （SGF）模擬人體胃液中的pH值，鹽離子濃度及胃蛋白酶濃度設(shè)置的消化液。2.3 模擬腸消化液 stimulated intestinal fluid （SIF）模擬人體腸液中的pH值，鹽離子濃度及胰酶濃度設(shè)置的消化液。2.4 穩(wěn)定對照蛋白 stable cont

4、rol protein為確認模擬消化體系正常工作而選取的在模擬胃/腸液中60 min內(nèi)不能被完全消化的蛋白質(zhì)。2.5 不穩(wěn)定對照蛋白 labile control protein為確認模擬消化體系正常工作而選取的在模擬胃/腸液中2 min內(nèi)完全被消化的蛋白質(zhì)。3 原理根據(jù)人體胃/腸消化液的主要成分及消化環(huán)境，在體外建立模擬胃/腸消化體系，將轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品中外源基因表達的蛋白質(zhì)在該體系中進行消化，對不同消化時間的樣品進行蛋白電泳和蛋白印跡，確定該蛋白在模擬胃液和模擬腸液中被消化的時間，推斷轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品中外源基因表達的蛋白質(zhì)在模擬人體胃/腸消化過程中的穩(wěn)定性。4 試劑和材料除非另有說明，

5、僅使用分析純化學試劑和重蒸餾水。4.1 模擬胃消化液（SGF）：本標準中采用的胃蛋白酶（pepsin）活力不能低于2000 U/mg。根據(jù)公式（1）計算100 mL模擬胃液中的胃蛋白酶的添加量：（1）A= 5×106 19×B 式中：A胃蛋白酶添加量，單位為毫克（mg）；B胃蛋白酶活力，單位為單位活力每毫克（U/mg）。稱取0.2 g 氯化鈉（NaCl）和A mg胃蛋白酶，加入70 mL重蒸餾水，加入730 µL鹽酸，再用鹽酸調(diào)pH至，加水定容至100 mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。4.2 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液：稱取0.8 g 氫氧化鈉（NaOH），溶于重蒸餾水中，

6、定容至100 mL。4.3 模擬腸消化液（SIF）：本標準中采用的胰酶（pancreatin）應滿足40 5min內(nèi)，能將其質(zhì)量的25倍的淀粉轉(zhuǎn)化為水溶性的碳水化合物； 40 60min內(nèi)（pH 7.5），消化掉其質(zhì)量的25倍的酪蛋白；37（pH 9.0），每毫克胰酶每分鐘能夠從橄欖油中至少水解生成2 µmol脂肪酸。稱取0.7 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于25 mL重蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，加入19 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液和40 mL重蒸餾水，加入1.0 g胰酶，用0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至，加重蒸餾水定容至100 mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。4.4

7、樣品蛋白溶液：4.4.1 模擬胃液消化樣品蛋白溶液（5 g/L）：稱取5 mg 樣品蛋白，定容于1 mL重蒸餾水中，混勻。4.4.2 模擬腸液消化樣品蛋白溶液（2 g/L）：稱取2 mg 樣品蛋白，定容于1 mL重蒸餾水中，混勻。4.5 不穩(wěn)定對照蛋白溶液：4.5.1 模擬胃液消化不穩(wěn)定對照蛋白溶液：選用酪蛋白（-casein）或牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為模擬胃液消化不穩(wěn)定對照。4.5.2 模擬腸液消化不穩(wěn)定對照蛋白溶液：選用酪蛋白（-casein）或牛-乳球蛋白B（bovine -lactoglobulin，BLG）作為模擬腸液消化不穩(wěn)定對照。配制方

8、法同4.4.2。 穩(wěn)定對照蛋白溶液：4.6.1 模擬胃液消化穩(wěn)定對照蛋白溶液：選用牛-乳球蛋白B（BLG）或大豆胰蛋白酶抑制劑（soybean trypsin inhibitor，STI）作為模擬胃液消化穩(wěn)定對照。配制方法同4.4.1。4.6.2 模擬腸液消化穩(wěn)定對照樣品溶液：選用牛血清白蛋白（BSA）或大豆胰蛋白酶抑制劑（STI）作為模擬腸液消化穩(wěn)定對照。配制方法同4.4.2。4.7 0.2 mol/L 碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液：稱取1.7 g碳酸氫鈉（NaHCO3），溶于重蒸餾水中，定容至100 mL。4.8 3 mol/L 鹽酸溶液：量取26 mL 鹽酸，加重蒸餾水定容至100 mL

9、。4.9 分離膠緩沖液（1.5 mol/L 三羥甲基氨基甲烷-）：稱取9.1 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），加45 mL重蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，用3 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至，再加水定容至50 mL，4下貯存?zhèn)溆谩?.10 濃縮膠緩沖液（1.0 mol/L三羥甲基氨基甲烷-）：稱取3.0 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），加45 mL重蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，用3 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH至，再加水定容至50 mL，4下貯存?zhèn)溆谩?.11 300 g/L 丙烯酰胺單體儲液（Acr/Bis）：稱取29.1 g丙烯酰胺（Acr）， g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺

10、（Bis），溶于80 mL重蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，加水定容至 100 mL，濾紙過濾，4下避光保存?zhèn)溆谩?100 g/L十二烷基磺酸鈉（SDS）：稱取5.0 g 十二烷基磺酸鈉（SDS）溶于45 mL重蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，加水定容至50 mL。4.13 100 g/L過硫酸銨（AP）：稱取0.1 g過硫酸銨（AP），溶于1 mL 重蒸餾水中。4中保存，并在1周內(nèi)使用。4.14 蛋白樣品上樣緩沖液（5×Laemmli buffer，）：稱取10.0 g十二烷基磺酸鈉（SDS），加入40 mL 甘油，33 mL 濃縮膠緩沖液（），5 mL巰基乙醇，加水定

11、容至100 mL，再加入0.05 g溴酚藍，混勻。4.15 50 g/L 三氯乙酸（TCA）：稱取5.0 g 三氯乙酸（TCA），溶于100 mL 重蒸餾水中。現(xiàn)用現(xiàn)配。4.16 十二烷基磺酸鈉（SDS）洗脫液：在455 mL甲醇中加入90 mL乙酸，用水定容至1000 mL。4.17 考馬斯亮藍染色液：量取150 mL 甲醇，100 mL冰乙酸，加水定容至1000 mL，再加入1.0 g考馬斯亮藍，混勻，濾紙過濾后使用。4.18 脫色液：在250 mL甲醇中加入75 mL乙酸，加水定容至1000 mL。4.19 電泳緩沖液：稱取3.0 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），14.4 g甘氨酸，1.

12、0 g十二烷基磺酸鈉（SDS），溶于800 mL重蒸餾水中，用3 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH至，加水定容至1000 mL。4.20 轉(zhuǎn)移緩沖液：稱取3.2 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），14.4 g甘氨酸，甲醇200 mL，加水定容至1000 mL。4.21 TBS緩沖液：稱取1.2 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），8.8 g氯化鈉（NaCl），加800 mL重蒸餾水，用3 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH至，加水定容至1000 mL。4.22 TBST1緩沖液：在500 mL TBS 緩沖液中，加入250 µL 吐溫20（Tween 20），用磁力攪拌器混勻。4.23 TBST2緩沖液

13、：稱取3.0 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），4.4 g氯化鈉（NaCl），加重蒸餾水400 mL，再加入500 µL 吐溫20（Tween 20），攪拌混勻，加水定容至500 mL。4.24 堿性磷酸酶顯色緩沖液：稱取 1.2 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），0.6 g 氯化鈉（NaCl），1.0 g氯化鎂（MgCl2·6H2O），加80 mL重蒸餾水溶解，定容至100 mL。4.25 蛋白印跡顯色液：加66 µL 四氮唑蘭（NBT）溶液于10 mL堿性磷酸酶緩沖液中，充分混勻后，加入33 µL 5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸鹽（BCIP）溶液，混勻?，F(xiàn)

14、用現(xiàn)配。4.26 封閉液：在50 mL TBST1緩沖液中加入1.5 g 牛血清白蛋白（BSA），混勻。 4.27 一抗工作液：在50 mL封閉液中，加入50 µl 目標蛋白抗血清。4.28 二抗工作液：在20 mL TBST2緩沖液中，加入0.2 g牛血清白蛋白（BSA），混勻溶解后，再加入20 µL堿性磷酸酶標記二抗。4.29 15%分離膠：按表1依次吸取各種組分于50 mL錐形瓶中，其間搖動混勻。表1 15%分離膠的配制各種溶液組分名稱各組分的取樣量（mL）重蒸餾水300 g/L丙烯酰胺儲液（Acr/Bis）分離膠緩沖液100 g/L 十二烷基磺酸鈉（SDS）100

15、g/L 過硫酸銨（AP）N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）總體積104.30 5%濃縮膠：按表2依次吸取各種組分于50 mL錐形瓶中，其間搖動混勻。表2 5%濃縮膠的配制各種溶液組分名稱各組分的取樣量（mL）重蒸餾水300 g/L丙烯酰胺儲液（Acr/Bis）濃縮膠緩沖液100 g/L 十二烷基磺酸鈉（SDS）100 g/L 過硫酸銨（AP）N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）總體積54.31 PVDF轉(zhuǎn)印膜。4.32 濾紙。5 儀器)。5.2 紫外分光光度計。5.3 電泳槽、電泳儀等蛋白電泳裝置。5.4 蛋白免疫印跡裝置。5.5 凝膠成像

16、系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。5.6 重蒸餾水發(fā)生器。5.7 可調(diào)式電爐。5.8 電子天平（感量0.0001 g與感量0.1 g）。5.9 其他分子生物學實驗室儀器設(shè)備。6 操作步驟6.1 模擬胃/腸液消化試驗反應時間反應時間設(shè)置為0s、15 s、2 min、30 min和60 min。6.2 試驗重復和平行樣品設(shè)置每個蛋白樣品重復進行兩次試驗，每次試驗進行三次電泳。6.3 模擬胃液消化試驗 反應時間為0s的模擬胃液消化試驗在1.5 mL離心管中加入190 µL 模擬胃消化液（SGF），37恒溫水浴5 min。加入10 L樣品蛋白溶液或?qū)φ盏鞍兹芤海? g/L），同時加入70 µL 0.

17、2 mol/L 碳酸氫鈉溶液，漩渦振蕩后，冰浴，加入70 µL蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.3.2 反應時間為15 s、2 min、30 min、60 min的模擬胃液消化試驗在7 mL離心管中加入1.9 mL模擬胃消化液（SGF），37恒溫水浴5 min。加入100 µL樣品蛋白溶液或?qū)φ盏鞍兹芤海? g/L），迅速漩渦振蕩并快速置于37水浴，準確記錄時間，在每個反應時間點，迅速吸取反應液200 µL，加入1.5 mL離心管中（含有70 µL 0.2 mol/L 碳酸氫鈉溶液），冰浴，加入70 µL蛋白樣品上

18、樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.3.3 胃蛋白酶對照在1.5 mL離心管中加入190 µL 模擬胃消化液（SGF），再加入10 µL重蒸餾水和70 µL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液，漩渦振蕩后，加入70 µL蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.3.4 試樣蛋白對照在1.5 mL離心管中加入190 µL不含胃蛋白酶的模擬胃緩沖液，再加入10 µL樣品蛋白或?qū)φ盏鞍祝? g/L），同時加入70 µL 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液，漩渦振蕩后，加入70 µL蛋白樣品

19、上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.4 模擬腸液消化試驗 反應時間為0s的模擬腸液消化試驗在1.5 mL離心管中加入190 µL 模擬腸消化液（SIF）溶液，37恒溫水浴5 min。加入10 L樣品蛋白溶液或?qū)φ盏鞍兹芤海? g/L），漩渦振蕩后，立即加入50 µL蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.4.2 反應時間為15 s、2 min、30 min、60 min的模擬腸液消化試驗在7 mL離心管中加入1.9 mL 模擬腸消化液（SIF）溶液，37恒溫水浴5 min。加入100 µL樣品蛋白溶液或?qū)φ盏鞍兹芤海?

20、g/L），迅速漩渦振蕩并快速置于37水浴中，準確記錄時間，在每個反應時間點，迅速吸取反應液200 µL，加入1.5 mL離心管中，立即加入50 µL蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.4.3 胰蛋白酶對照在1.5 mL離心管中加入190 µL 模擬腸消化液（SIF），再加入10 µL重蒸餾水，漩渦振蕩后，立即加入50 µL蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6. 試樣蛋白對照在1.5 mL離心管中加入190 µL 不含胰酶的模擬腸緩沖液，再加入10 µL樣品蛋白或?qū)φ盏鞍祝?/p>

21、2 g/L），漩渦振蕩后，立即加入50 µL蛋白樣品上樣緩沖液，沸水浴5 min，取出后冷卻至室溫備用。6.5 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)6.5.1 取出兩塊玻璃板，用自來水洗凈后，蒸餾水沖洗一次，置37烘干或晾干，梳子用自來水洗凈，晾干。 分離膠的制備在50 mL錐形瓶中依次加入表1中的溶液，輕輕搖動混勻溶液，避免氣泡產(chǎn)生。以平穩(wěn)流速緩慢地將分離膠溶液從玻璃夾板的中間位置注入玻璃夾板中，在液面距凹板上平面2-3 cm處停止注入，再以相同的方法將水注入玻璃夾板中，水面距分離膠液面約2-3 cm時停止注入，靜置至凝膠形成。 濃縮膠的制備在50 mL錐形瓶中依

22、次加入表2中的溶液，輕輕搖動混勻溶液，避免氣泡產(chǎn)生。待分離膠完全聚合（膠面與上面的水相有明顯的界面），吸凈上層液體。以平穩(wěn)流速緩慢地將濃縮膠溶液從玻璃夾板的中間位置注入玻璃夾板中，直到凹形玻璃板頂端，立即小心插入梳子。6.5.4 待濃縮膠完全聚合后，取下夾子和環(huán)繞在玻璃板周圍的乳膠條，不要改變玻璃板的相對位置。6.5.5 在電泳槽兩側(cè)的電極槽中注入電泳緩沖液，緩沖液與凝膠上下兩端之間避免產(chǎn)生氣泡。小心取下梳子。6.5.6 在玻璃板上做記號，將6.3、6.4處理的樣品取15 µL加入點樣孔中。 樣品加入順序：1：蛋白marker；2：蛋白酶對照樣品；3：試樣蛋白對照樣品；4-8：模擬胃

23、/腸液消化樣品（0 s，15 s，2 min，30 min，60 min）。6.5.7 接好電泳槽正負極，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至80 V，以恒電壓方式電泳。當溴酚藍染料前沿進入分離膠后，電壓提高到120 V，直至溴酚藍遷移至凝膠下端附近，約距下端1 cm左右，關(guān)閉電源，停止電泳。6.5.8 從電泳裝置上卸下雙層玻璃夾板，撬開玻璃板，在凝膠點樣孔上部切除一角標注凝膠的方位。6.5.9 將凝膠在50 g/L 三氯乙酸（TCA）溶液中輕輕振蕩5 min，取出后在十二烷基磺酸鈉（SDS）洗脫液中振蕩12 h。6.5.10 取出后在考馬斯亮藍染色液中浸泡染色10 min以上，然后用脫色液脫色直至條帶清

24、晰。6.5.11 取出凝膠，置于凝膠成像儀上，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)照相，并保存圖像。 蛋白印跡（此步操作僅針對測試樣品蛋白）6.6.1 按進行SDS-PAGE。6.6.2 從玻璃板上取下凝膠，切除所有濃縮膠。根據(jù)分離膠的大小，剪成與凝膠同樣大小的PVDF轉(zhuǎn)印膜和濾紙6張。6.6.3 將凝膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中15-30 min。6.6.4 將濾紙浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中30 s以上。6.6.5 在甲醇中潤濕PVDF轉(zhuǎn)印膜15 s，使膜均勻地由不透明變成半透明。小心將膜放入重蒸餾水中浸泡2 min，再將膜小心放入轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5 min以上。6.6.6 將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，轉(zhuǎn)移夾的凝膠側(cè)面面向陰極（-），膜側(cè)面面向陽極（+）。向轉(zhuǎn)移槽中加入適量緩沖液，將轉(zhuǎn)移夾完全浸沒。于4冰箱中連接轉(zhuǎn)移裝置正負極，打開