個(gè)人整理總結(jié)神經(jīng)細(xì)胞和胚胎細(xì)胞培養(yǎng)操作注意事項(xiàng)及相關(guān)protocols

1、Drosophila S2 cell culture protocols陳文鋒一、基本注意事項(xiàng)（一）無菌操作培養(yǎng)所需一切物品、液體應(yīng)無菌。操作前先列出所需物品，培養(yǎng)液須室溫平衡，所有物品準(zhǔn)備好后再操作，避免往復(fù)拿取用品。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。（二）操作區(qū)消毒進(jìn)入細(xì)胞室內(nèi)換穿里面的拖鞋。無菌培養(yǎng)室每周用0.2%的新潔而滅（苯扎溴銨）拖地面1次（拖布專用），紫外照射15-30min。超凈工作臺使用前后需用75%乙醇擦洗，然后進(jìn)行紫外燈照射1530min進(jìn)行消毒，操作時(shí)打開風(fēng)機(jī)。紫外照射期間不能放置培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)液等。所有進(jìn)入操作區(qū)域的物品需經(jīng)75%乙醇擦拭消毒。工作臺面均需經(jīng)75%乙醇擦拭消毒

2、，特別是液體溢出時(shí)，需立即擦拭。移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%乙醇擦洗后置于臺內(nèi)同時(shí)紫外照射消毒。廢液缸、污物盒每次做完實(shí)驗(yàn)馬上清理倒掉。（三）洗手和著裝乳膠手套75%乙醇噴灑消毒。白大褂定期高溫高壓滅菌。（四）火焰消毒培養(yǎng)或其他無菌操作時(shí)，首先點(diǎn)燃酒精燈。安裝管帽、打開或封閉瓶口等，都需要在火焰近處。二、細(xì)胞培養(yǎng)條件S2細(xì)胞培養(yǎng)在Schneider's Drosophila Medium + 10% FBS的培養(yǎng)基中+100U/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素，25無需要CO2培養(yǎng)。五、FBS分裝及滅活分裝：初次買500ml血清，4完全融化（過夜差不多20h，時(shí)間比較長）

3、，期間間隔混勻。無菌操作分裝于50ml離心管（直接倒，但是注意不要讓血清瓶和離心管接觸）。同時(shí)分裝幾管15ml的（15ml不好倒就用槍或移液管操作）。（-80保存）再次分裝：等15ml的分裝血清用完。把50ml的血清取出，4完全融化，期間間隔混勻。無菌操作分裝于15ml離心管。滅活：把裝有滅菌水的燒杯置于56水浴鍋中，等水浴鍋溫度恒定，把裝有血清的15ml離心管放于燒杯中，水位應(yīng)超過血清的位置。滅活30 min，每隔10min混勻一次。六、槍頭、槍消毒槍頭：細(xì)胞用1ml槍頭為加長的槍頭（放于507柜子上），細(xì)胞室有三個(gè)盒子可以裝此槍頭。其余型號槍頭為普通槍頭。裝槍頭時(shí)戴上手套盡量在507超凈臺

4、操作，滅菌時(shí)一定用報(bào)紙包上。滅完烘干放回細(xì)胞室備用。槍：可高溫高壓滅菌。定期滅菌時(shí)包上錫箔紙高溫高壓滅菌后烘干。七、培養(yǎng)基配制Schneiders/ 10% FBS/PS（抗生素可以不加）表1 不同體積的完全培養(yǎng)配置Schneider medium225ml450ml45mlFBS25ml50ml5ml青霉素125ul（20萬單位/ml=200U/ul）250ul25ul鏈霉素125ul（0.2g/ml）250ul25ul青霉素鏈霉素每瓶加4ml每瓶加5ml分裝300ul/管分裝300ul/管1、450ml Schneiders 培養(yǎng)基 （Sigma or Gibco 11720-034 or

5、 Lonza 04-351Q）2、加入50 ml FBS（熱滅活過）。3、5ml 1：100青霉素和鏈霉素。-20保存。（最終濃度為青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml。一般市售青霉素為80萬單位/瓶，將其溶解于4ml三蒸水中（20萬單位/ml），每升培養(yǎng)基中加入0.5ml；市售鏈霉素為1克/瓶，將其溶解于5ml中（0.2g/ml），每升加入0.5ml）。接mini-Q水，過濾膜，然后溶解抗生素。4、0.2u過濾后4保存。八、培養(yǎng)箱設(shè)置培養(yǎng)箱中放置水盤保持一定濕度：水盤中用去離子水或滅菌蒸餾水配置2%的硫酸銅。水盤定期更換，保證水不會全部揮發(fā)干。九、消毒液配置75%乙醇配置（手、超凈臺

6、臺面消毒）：210毫升的純凈水790毫升的95%乙醇1升75%乙醇溶液。0.2%新潔爾滅配置（地板、臺面等消毒）：500ml新潔爾滅+7000ml蒸餾水250ml新潔爾滅+3500ml蒸餾水100ml新潔爾滅+1400ml蒸餾水50ml新潔爾滅+700ml蒸餾水十、解凍細(xì)胞（細(xì)胞復(fù)蘇）每個(gè)凍存管大約有1ml細(xì)胞懸浮液（大約2×107個(gè)/ml）。解凍細(xì)胞程序：1、把冰箱中的培養(yǎng)基提前15-30min恢復(fù)至室溫。吸取5ml完全培養(yǎng)基于T-25培養(yǎng)瓶。（DGRC有推薦培養(yǎng)基用量，見附件1）注：用60mm培養(yǎng)皿+4ml培養(yǎng)液也行，但是對于長得慢的細(xì)胞不推薦，因?yàn)榕囵B(yǎng)皿容易揮發(fā)水蒸氣。2、用槍

7、頭吸取一定量培養(yǎng)液于凍存管，吹打混勻細(xì)胞。把細(xì)胞吸取到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。注：不推薦用水浴的方法解凍細(xì)胞。把培養(yǎng)瓶放于培養(yǎng)箱中1-2 h。3、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀況。通常，大多數(shù)細(xì)胞在這個(gè)時(shí)候松弛地貼壁。如果是這樣，輕輕地移除上清，換新的培養(yǎng)基。這步的目的是移掉DMSO（對細(xì)胞有毒）。把培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱過夜，第二天重復(fù)前步操作。注：S2細(xì)胞對DMSO不敏感，但是換培養(yǎng)液可移除凍過不好的細(xì)胞。注：如果1-2h之后看細(xì)胞還是懸浮，用離心的方法移除掉漂浮的細(xì)胞：把細(xì)胞液從培養(yǎng)瓶吸到離心管。加新的培養(yǎng)基到培養(yǎng)瓶子。離心細(xì)胞液除去上清。用來自培養(yǎng)瓶中的1ml培養(yǎng)基重懸沉淀（可能看不到）。把重懸浮的液體吸回

8、培養(yǎng)瓶。4、有些細(xì)胞可能要很長的時(shí)間才能開始長。如果2周細(xì)胞還不能transferred，吸掉一半培養(yǎng)基，加入新的。如果必要，重復(fù)此操作。十一、別人饋贈的細(xì)胞（培養(yǎng)瓶）把培養(yǎng)瓶放平，讓細(xì)胞沉到底部。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度。如果1瓶底部已經(jīng)長滿一層細(xì)胞：輕輕懸浮細(xì)胞，然后把細(xì)胞懸浮液換到新的培養(yǎng)瓶或板，原始的培養(yǎng)瓶留下5ml培養(yǎng)基。把它們放入培養(yǎng)箱生長。如果2沒有足夠的細(xì)胞覆蓋住培養(yǎng)瓶底部：吸掉大部分培養(yǎng)基，留下5ml。放入培養(yǎng)箱生長。細(xì)胞長到合適的時(shí)候就可以凍存。通常，果蠅細(xì)胞生長范圍106-107個(gè)/ml。在107個(gè)/ml的時(shí)候，細(xì)胞完全覆蓋住培養(yǎng)瓶或皿底部。100mm培養(yǎng)皿 10ml培養(yǎng)基

9、60mm 培養(yǎng)皿 4ml培養(yǎng)基25cm 培養(yǎng)瓶 5ml培養(yǎng)基6-well 2ml12-well 1ml24-well 0.5ml十二、細(xì)胞傳代1、在細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥中，用滅菌過的槍頭吸掉舊培養(yǎng)液體；（棄掉舊液，加入新液，再分瓶培養(yǎng)。）2、吸掉培養(yǎng)液體，加入新的培養(yǎng)液，直接用吸管將細(xì)胞吹打下來接種到新的培養(yǎng)瓶。也可以不棄掉舊培養(yǎng)液，直接用舊的培養(yǎng)液將細(xì)胞分配到新的培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)加新的培養(yǎng)液（我做過發(fā)現(xiàn)效果不好）。注：用吸管吹打細(xì)胞時(shí)，應(yīng)避免起泡，且不要刮培養(yǎng)瓶。3、按一定比例將細(xì)胞懸浮液接種在含有新的細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。（一般接種成濃度5x105個(gè)/ml）十三、細(xì)胞計(jì)數(shù)

10、我們用的血球計(jì)數(shù)為25中方格子的，共有兩邊計(jì)數(shù)室。每次兩邊計(jì)數(shù)室各挑取5個(gè)中方格進(jìn)行計(jì)數(shù)。1、把計(jì)數(shù)板取出，蓋上蓋玻片。2、把要計(jì)數(shù)的細(xì)胞在1.5ml離心管中用滅菌水稀釋，充分混勻。3、用槍吸取20-30ul稀釋液體，用虹吸的原理讓稀釋液進(jìn)入到細(xì)胞計(jì)數(shù)室。4、在熒光顯微鏡白光（10X）下找到視野。5、計(jì)算兩邊計(jì)數(shù)室各5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)。記為C1和C2。細(xì)胞濃度=×稀釋倍數(shù)（個(gè)/ml）十四、凍存生長到合適狀態(tài)的細(xì)胞材料：Schneider medium 35ml +FBS 10ml + DMSO 5ml（放于細(xì)胞室柜子上）（4保存）冷藏的培養(yǎng)基：培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO。無菌

11、過濾(要制備濾膜除菌的DMSO溶液，推薦使用teflon或nylon膜)，我們沒有過濾，直接使用；4保存。凍存管（康寧公司）棉花和牛皮紙Produce:1、細(xì)胞生長到大約5×106個(gè)/ml（mid-exponential growth）。2、收集細(xì)胞液離心，去上清。室溫800-1000rpm，離心5min。3、用冷藏的培養(yǎng)基重懸，0.25×原始體積（4ml*0.25=1ml or 5ml*0.25=1.25ml）。得到約2×107個(gè)/ml的細(xì)胞。4、用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞均勻。5、分裝上清到凍存管子，0.5ml或1ml每管。6、封口膜封上管口，包上棉花，包上牛皮紙，綁上帶子。7、放入-80過夜或2-3天。（-80保存我們試過至少可以保存半年）8、轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。附件1：不同培養(yǎng)瓶需要培養(yǎng)液量BG-2c培養(yǎng)基配方：10mg/ml insulin 母液配制：準(zhǔn)備0.01N HCL：2.59ul Hcl+3ml ddH2O=0.01N Hcl（Xml*11.6N）/3ml=0.01N把insulin分到1.5ml離心管，通過減法算出insulin質(zhì)量mg，每10mg加1ml的0.01N Hcl，溶解insulin，配成10mg/ml, 分裝200ul 10mg/ml母液。