人組織激肽釋放酶對(duì)腦組織的保護(hù)作用的研究進(jìn)展

1、 人組織激肽釋放酶對(duì)腦組織的保護(hù)作用的研究進(jìn)展周樂(lè)平 王均爐 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科 1909年，Abelous等首次報(bào)告了尿液中具有降壓作用的物質(zhì)即尿激肽釋放酶。人尿激肽釋放酶（human urinary kallikrein, HUK）是分泌到尿液的組織激肽釋放酶（human tissue kallikrein, HTK），它通過(guò)激肽釋放酶激肽系統(tǒng)（kallikreinkinin system ,KKS）參與人體多器官功能調(diào)節(jié)和多種病理生理過(guò)程，具有調(diào)節(jié)心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、舒張血管，參與炎癥反應(yīng)、疼痛刺激和休克反應(yīng) 13。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)人組織激

2、肽釋放酶（HTK）的研究也日漸深入，涉及的領(lǐng)域也更廣泛，如HUK在缺血/再灌注損傷中的作用，KKS受體與新生血管形成的關(guān)系等?，F(xiàn)就HUK對(duì)腦組織保護(hù)作用的研究進(jìn)展闡述如下。1 組織激肽釋放酶的生物學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)制人體內(nèi)的激肽釋放酶包括血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶,二者分別由前激肽釋放酶（prekalikrein）和激肽釋放酶原（prokallikrein）轉(zhuǎn)換而來(lái)。血漿激肽釋放酶催化高分子激肽原水解，生成緩激肽（bradykinin）和胰激肽（kallidin）3,4。在人體內(nèi)，組織激肽釋放酶又稱為胰/腎激肽釋放酶4，它能催化低分子激肽原水解，生成胰激肽。緩激肽和胰激肽在激肽酶I的作用下羧基

3、端水解掉Arg，分別生成des-Arg_-BK和des-Arg_-kallidin，后者仍具有生物活性，需要血管緊張素轉(zhuǎn)化酶或氨基肽酶才能完全滅活35 激肽主要與G蛋白耦聯(lián)的B1 R，B2 R結(jié)合發(fā)揮作用。B2 R為管家基因表達(dá)，是正常狀態(tài)下激肽發(fā)揮作用的主要受體，對(duì)緩激肽，胰激肽敏感；而B(niǎo)1R在炎癥和缺血等損傷下誘導(dǎo)生成，對(duì)des-Arg_-kallidin，des-Arg -BK敏感，其中B1 R對(duì)des-Arg_-kallidin的敏感度大于des-Arg -BK。目前認(rèn)為B1R可能參與損傷部位的炎癥反應(yīng)和循環(huán)改善，并在新生血管生成中起重要作用5,6。 激肽與受體結(jié)合后，激活NO-CGM

4、P和PG-CAMP途徑，從而調(diào)節(jié)NO和PG等生物活性物質(zhì)的釋放來(lái)參與多器官功能調(diào)節(jié)和多種病生過(guò)程，如抑制凋亡、炎癥、肥大、纖維化，促進(jìn)心腎腦血管的新生血管的生成和腦的新生神經(jīng)的生成7,8。2 組織激肽釋放酶在心血管及腎臟的保護(hù)作用 HTK 廣泛存在于人腎、心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰、腸等臟器中，并通過(guò)其代謝產(chǎn)物與受體結(jié)合，來(lái)發(fā)揮其廣泛的病理生理作用6。其中以HTK 在心血管及腎疾病方面的研究最多。KKS在維持正常血壓，保護(hù)心臟方面起重要作用，KKS缺陷會(huì)引起高血壓，Berry在1989年對(duì)一份家族進(jìn)行的研究顯示HUK可減少高血壓的風(fēng)險(xiǎn)。許多高血壓或心肌缺血再灌注(IR)模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，以腺病

5、毒為載體的人組織激肽釋放酶基因（ad. htk）轉(zhuǎn)導(dǎo)能降低高血壓，緩解心肌肥厚和纖維化，還可提高心臟功能，減少心肌梗死范圍，減少心肌IR后的室顫和凋亡2,5。HUK是一種顯著的腎血管擴(kuò)張劑，利尿劑，促鈉排泄劑，能保護(hù)腎臟。HUK下降會(huì)引起住院病人輕度腎病，嚴(yán)重者可引起嚴(yán)重腎衰，KKS可通過(guò)抑制炎癥和氧化酶來(lái)對(duì)抗高鹽飲食或藥物引起的腎衰2,9。3 組織激肽釋放酶對(duì)腦組織的保護(hù)作用在人類，已證實(shí)組織激肽釋放酶分布在丘腦、下丘腦、腦灰質(zhì)、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元和腺垂體細(xì)胞及脈絡(luò)叢細(xì)胞上10。B2R在人星形神經(jīng)膠質(zhì)、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、大腦皮質(zhì)、紋狀體、丘腦、下丘腦的神經(jīng)元上都有表

6、達(dá)。而B(niǎo)1R在丘腦、下丘腦的神經(jīng)元和基底動(dòng)脈中有表達(dá) 6,11。體外研究顯示人類B1R在血管內(nèi)皮細(xì)胞、大動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈、肌性小動(dòng)脈中都有存在12。在缺血等損傷或炎癥時(shí)，B1R表達(dá)上調(diào)。這些都為組織激肽釋放酶通過(guò)代謝產(chǎn)物激肽結(jié)合B1R和B2R來(lái)保護(hù)腦組織提供了前提，具體的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制表現(xiàn)如下：3.1 擴(kuò)張腦動(dòng)脈，改善缺血腦組織血供和氧供人們對(duì)腦缺血的病理生理進(jìn)行了深入研究,并提出了多種學(xué)說(shuō)，但迄今為止沒(méi)有一種機(jī)制能完全闡明腦缺血的損傷機(jī)制?，F(xiàn)認(rèn)為參與腦缺血損傷的分子機(jī)制有興奮性氨基酸的釋放、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、自由基的形成、蛋白酶的激活及NO的介導(dǎo)作用等13,14。NO在腦缺

7、血損害中所起的作用一直是研究的熱點(diǎn)。NO具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒素雙重作用。目前認(rèn)為NO的雙重作用與其產(chǎn)生來(lái)源有關(guān)，NO由NOS 催化底物L(fēng) - 精氨酸合成。NOS 可分為結(jié)構(gòu)型(cNOS) 和誘導(dǎo)型(iNOS) ,cNOS 包括內(nèi)皮源性(eNOS) 和神經(jīng)源性(nNOS) 。實(shí)驗(yàn)證明,源于iNOS和nNOS過(guò)度表達(dá)所形成的NO有神經(jīng)毒性,而源于eNOS所產(chǎn)生的NO卻有神經(jīng)保護(hù)作用15。所以能通過(guò)上調(diào)eNOS來(lái)增加NO的藥物能起神經(jīng)保護(hù)作用。B1R和B2R是特殊的可調(diào)節(jié)的G蛋白耦聯(lián)受體，已證實(shí)它們?cè)趦?nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相同。當(dāng)激肽與B1 R或B2 R結(jié)合后，受體胞內(nèi)端耦聯(lián)的G蛋白激活磷酸酯

8、酶C(PLC)激活,PLC進(jìn)一步水解4，5二磷酸肌醇（IP3），IP3彌散到胞漿中與肌漿網(wǎng)中IP3受體結(jié)合，引起貯庫(kù)中Ca2+釋放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，最后激活eNOS,產(chǎn)生NO。胞內(nèi)Ca2+增加還激活磷脂酶A2（PLA2），誘生PGI211,9。Lamontagne，Be´lichard 等指出des-Arg_-BK擴(kuò)血管作用至少部分由NO介導(dǎo)，PG似乎不重要16。激肽擴(kuò)張腦動(dòng)脈的作用部分來(lái)自NO的釋放8。急性中風(fēng)病人在缺血發(fā)作起始后8天期間外周循環(huán)中胰激肽升高11。Simone 17等研究顯示：22例較大梗死灶的大腦中動(dòng)脈閉塞患者較14例正常成人，其組織激肽

9、釋放酶濃度呈升高趨勢(shì)，胰激肽濃度升高。這些都說(shuō)明在缺血腦組織中，組織激肽釋放酶和胰激肽激活。胰激肽具有明顯的擴(kuò)張血管作用。胰激肽及其代謝物des-Arg_-kallidin能分別與B2R,B1R結(jié)合并釋放NO，擴(kuò)張腦動(dòng)脈。在正常人和動(dòng)物，擴(kuò)血管作用主要由B2R介導(dǎo);而在炎癥或缺血等損傷情況下，主要由新表達(dá)的B1R介導(dǎo)擴(kuò)血管作用。如在病理情況下，B1R顯示出比B2R更明顯的擴(kuò)張冠脈的作用12,16,18。在急性腦梗死等缺血性損傷時(shí)，缺血部位血管細(xì)胞被誘導(dǎo)生成B1R，此時(shí)激肽即與B1R結(jié)合擴(kuò)張缺血區(qū)腦組織的動(dòng)脈血管，從而改善缺血腦組織血供和氧供。3.2促進(jìn)缺血腦組織的新生血管的生成 在外周血管病的

10、病人和動(dòng)物模型中顯示KKS上調(diào)，KKS在心肌/四肢缺血性疾病中的促進(jìn)新生血管形成和抑制細(xì)胞凋亡中起重要作用。有理論認(rèn)為，激肽通過(guò)增強(qiáng)血管形成對(duì)缺血組織存在長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)作用。局部轉(zhuǎn)導(dǎo)HTK基因能引起該區(qū)血管生成和促進(jìn)組織恢復(fù)?；铙w實(shí)驗(yàn)表明，HTK 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能促進(jìn)兔角膜新生血管的生成和毛細(xì)血管增生。有研究表明，低劑量（106 PFU）的ad. htk 轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠能促進(jìn)四肢肌肉毛細(xì)血管、動(dòng)脈的生長(zhǎng)，107 PFU的ad.htk可使微血管進(jìn)一步擴(kuò)張。對(duì)鏈脲霉素引起的糖尿病小鼠，局部予KLK能使其后肢骨骼肌微血管減少的進(jìn)程中止。這一作用是通過(guò)抑制凋亡，促進(jìn)血管再生來(lái)實(shí)現(xiàn)的。運(yùn)用組織激肽釋放酶抑制劑KLK

11、結(jié)合蛋白抑制KLK后，可觀察到其抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮的增值并誘導(dǎo)其凋亡，最終抑制新生血管的形成2,19-21。在體外研究中發(fā)現(xiàn)，激肽通過(guò)IP3-AKt/蛋白激酶B(即IP3-AKtB)或鈣調(diào)蛋白途徑激活內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS），從而使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體通過(guò)eNOS介導(dǎo)引起基質(zhì)層內(nèi)皮細(xì)胞形成。體內(nèi)研究表明，AKtB和eNOS與ad.htk引起的新生血管形成通路是功能相關(guān)的。ad.htk誘導(dǎo)生成的激肽與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A共同發(fā)揮以下作用：誘發(fā)血管生成，產(chǎn)生NO，舒張血管19。藥理學(xué)研究表明：B1R在毛細(xì)血管增殖方面起作用22-26。B1R在缺血性損傷中不僅直接調(diào)解內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活（激肽能有效

12、吸引白細(xì)胞，白細(xì)胞是產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子需要的），還能通過(guò)增加血管外血漿蛋白的滲出來(lái)參與缺血后新生血管的生成（這些蛋白為血管形成提供臨時(shí)支架）。新近有研究表明：遺傳性B1R缺乏則修復(fù)性的新生血管就不能形成19, 20,27。所以，B1R在促進(jìn)缺血組織的新生血管的生成中起重要作用。在急性腦缺血和細(xì)胞損傷時(shí)，缺血部位細(xì)胞B1R表達(dá)上調(diào)，組織激肽釋放酶通過(guò)代謝產(chǎn)物des-Arg_-kallidin與B1R結(jié)合，并進(jìn)一步通過(guò)IP3-AKtB或鈣調(diào)蛋白途徑激活內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS），從而促進(jìn)缺血腦組織的新生血管的生成。3.3促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞遷移和抑制細(xì)胞凋亡，減少炎癥細(xì)胞的侵潤(rùn)不同的動(dòng)物模型都表明

13、組織激肽釋放酶（KLK）通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)來(lái)減少心腎腦等器官損傷2,28。Julie Chao和 Lee Chao在阻斷大腦中動(dòng)脈（MCAO）造成大鼠局部腦缺血的模型中，將導(dǎo)入腦室后，能明顯減少缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)功能損傷，縮小腦梗死面積，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存活和遷移至缺血性半影區(qū)和中心，減少神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，炎癥細(xì)胞的侵潤(rùn)，促進(jìn)新生血管生成和神經(jīng)細(xì)胞再生，從而提高了存活率8。腦MCAO后靜脈持續(xù)微泵輸入人組織激肽釋放酶對(duì)缺血再灌注引起的行動(dòng)障礙等神經(jīng)功能恢復(fù)有直接作用29。 MCAO引起的腦缺血再灌注破壞了血腦屏障，KLK基因或蛋白可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦缺血損傷區(qū)，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)

14、保護(hù)作用29。形態(tài)學(xué)分析顯示：KLK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)了存活率，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞遷移至缺血性半影區(qū)和中心。KLK基因?qū)牒蠹?xì)胞存活率提高與與升高腦中NO水平和phospho-Akt,Bcl-2水平，減少半胱天冬酶3活化，降低NAD(P)H氧化酶活性，抑制超氧化物產(chǎn)生有關(guān)。這說(shuō)明KLK基因或蛋白轉(zhuǎn)入對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用不依賴于其擴(kuò)血管，降血壓作用，而是通過(guò)以下途徑：促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞存活和遷移，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和抑制Akt-Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制凋亡8。研究顯示激肽在細(xì)胞遷移和凋亡方面的效應(yīng)能被B2 R拮抗劑艾替班特阻滯，表明B2 R介導(dǎo)這些作用，B2 R在保護(hù)缺血腦卒中的作用同時(shí)也在B2 R

15、缺陷鼠中得以證實(shí)。B2 R缺陷鼠在缺血再灌注（I/R）損傷后比野生型鼠表現(xiàn)出更明顯的梗死范圍和凋亡，更嚴(yán)重的行動(dòng)障礙。它們?cè)谌毖?天白細(xì)胞聚集比野生型鼠減少，但在缺血第3天白細(xì)胞聚集比野生型鼠多。 h h）用B2 R拮抗劑可通過(guò)抑制水腫形成來(lái)減弱一過(guò)性腦缺血損傷。以上表明B2R有雙重的效應(yīng)：缺血早期促進(jìn)炎癥細(xì)胞的侵潤(rùn)，引起血管滲透性增加，但晚期通過(guò)促進(jìn)Akt磷酸化，降低NAD(P)H氧化酶活性，抑制超氧化物起神經(jīng)保護(hù)作用8, 29。3.4拮抗血管損傷，抑制動(dòng)脈肥厚 Murakami等在給行血管球囊成形術(shù)后鼠左頸總動(dòng)脈局部轉(zhuǎn)導(dǎo)KLK基因后，動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜比值明顯比對(duì)照組低，這一作用被NOS抑制劑L-NAME拮抗，說(shuō)明它是NO依賴性的。Emanueli等在鼠動(dòng)脈重構(gòu)模型中，發(fā)現(xiàn)全身給KLK基因通過(guò)改變血管剪切應(yīng)力來(lái)減少新內(nèi)膜形成2。zhang等在高鹽飲食引起的鼠高血壓腦出血模型中轉(zhuǎn)導(dǎo)KLK基因后，顯著緩解高血壓，抑制動(dòng)脈肥厚，減輕腦血腫，正是通過(guò)以上作用，組織激肽釋放