分子生物學在獲取中藥有效成分方面的研究與應用

1、分子生物學在獲取中藥有效成分方面的研究與應用摘要：中藥有效成分的提取是中藥研究的一個重要任務， 一種藥材經(jīng)過復雜的分離提取后獲得的有效成分往往十分微量。如何獲得更多的有效成分是中藥研究的重要內(nèi)容。分子生物學技術能為此研究提供新的方法，研究人員通過尋找中藥有效成分的相關功能基因，并通過基因工程的方法對其進行高效表達，大大提高了中藥有效成分的得率，并降低了提取成本。 關鍵字：分子生物學 有效成分 中藥 石斛當今，以分子生物學理論為基礎，以基因工程為主導的生物技術正以其巨大的活力推動著生命各學科的發(fā)展。進入21世紀，這一高新技術，在中醫(yī)藥研究領域中亦開始陸續(xù)被推廣應甩。綜合近幾年國內(nèi)外的研究 成果，

2、主要有以下幾個方面：1 分子生物學與中藥鑒定 中藥的傳統(tǒng)鑒定方法主要依靠基源鑒定、 性狀鑒定、 顯微鑒定以及理化鑒定四大類方法。單純依賴于以上傳統(tǒng)的鑒定方法，已經(jīng)不能有效防止中藥的混淆代用和故意偽制的發(fā)生?；?DNA分析的分子鑒定技術，具有特異性高、準確性高、重現(xiàn)性好的特點，已成為傳統(tǒng)鑒定方法的重要補充手段為中藥品質(zhì)標準規(guī)范管理的國際化開創(chuàng)良好開端。 2 分子生物學與中藥資源保護 傳統(tǒng)的藥用植物資源研究，主要采用形態(tài)分類學方法劃分物種。由于此方法僅建立在個體形狀描述和宏觀觀測的水平上，得到的結(jié)論并不完善。通過引入分子生物學方法， 分析藥用植物的遺傳特性以及建立遺傳圖譜，使植物分類和資源的研究

3、更加科學化1。肉蓯蓉屬名貴中藥材，主要來源植物為荒漠肉蓯蓉和管花肉蓯蓉，目前野生肉蓯蓉資源已僅剩幾 個主產(chǎn)區(qū)。 通過提取樣本DNA，運 用 RAPD技術對荒漠肉蓯蓉野生居群和管花肉蓯蓉 野生居群進行研究，利用POPGENE32版軟件分析其群體的遺傳多樣性。結(jié)果顯示，兩種肉蓯蓉的遺傳多樣性均呈低下，不利于其適應環(huán)境變化的能力。 通過分析肉蓯蓉遺傳多樣性的差異，為如何保護肉 蓯蓉提供了科學的實驗遺傳學依據(jù)2。3 分子生物學與中藥的機理研究中藥的機理研究通過應用分子生物學技術已深入到幾乎是最根本的基因轉(zhuǎn)錄水平， 并在該水平上對中藥的療效獲得了一定解釋，但整體上還處于探索階段。已有的研究主要是應用如核

4、酸分子雜交、RT -PCR技術等考察“單基因” 的技術，應用如DD -PCR、DNA陣列等研究多基因的技術的報道較少。 中藥調(diào)節(jié)機體平衡的特點決定了對基因轉(zhuǎn)錄的影響很可能是對多基因的協(xié)同影響， 如對補腎生血方的系列研究已表明此方的功效與影響EPOR、 SCF、c-myc、Bcl- 2、GM-CSF基因表達有關。因此，應用研究多基因表達的技術考察對多基因的協(xié)同影響將是未來中藥基因轉(zhuǎn)錄水平作用機理研究的主要方向。相信隨著現(xiàn)有技術的不斷發(fā)展和完善、新技術的出現(xiàn)及多種技術相結(jié)合加上疾病細胞分子水平研究的深入，復雜的中藥作用機理會逐步得到闡釋，中藥的療效和可能發(fā)現(xiàn)的新功效將從機理上獲得科學依據(jù)，為中藥獲

5、得像西藥一樣的市場準人權提供有力的支撐3。： 雖然隨著科學技術的進步，中藥材的提取方法得到了飛速發(fā)展，一些新的提取方法如超聲提取技術、超臨界流體提取技術、微波輔助提取技術、半仿生提取技術等得到一定的應用，但各種方法不但有自身存在的缺點，更重要的是它們不能從根本上增加藥材有效成分的含量。因此，在一味的追求更好的提取方法的同時，也應該在提高藥材自身成分含量上作出相應的研究4。本文以下主要介紹該方法的研究與應用概況。該方法目前主要是利用理化因子定向誘導藥材某個藥用部位，如根莖、種子等， 獲得穩(wěn)定的藥材藥用部位突變體， 并運用cDNA -AFL技術對突變體表達進行分析；以Mrna - cDNA克隆法，

6、單克隆抗體等構(gòu)建以獲得差異表達 mRNA反義基因； 構(gòu)建相應的載體，轉(zhuǎn)化藥材，分析轉(zhuǎn)基因石斛中的成分石斛堿的變化 ， 對反義基因進行篩選，確定石斛堿功能基因； 并進行基因的全長克隆， 從而獲得藥材有效成分相關功能基因， 再進一步對運用基因工程方法對藥材有效成分進行大規(guī)模生產(chǎn)打下基礎。 單克隆抗體是由單個細胞(雜交瘤細胞)增殖而形成的細胞克隆所產(chǎn)生的完全均一的、單一特異性的抗體。因此，制作出針對中藥不同成份的單克隆抗體，然后用來鑒定中藥的成份或測定其含量的多少。是一種簡便而又高靈敏度的、重復性好的測定方法。而且，單克隆抗體不僅可以作為測定試劑還可以制成親和層析柱，迅速地、高特異性地從復合物中提取

7、出相應的有效成份5。 石斛為傳統(tǒng)名貴中藥材，為蘭科(Orchidaceae)石斛屬( Dend obium Sw)， 以新鮮或干燥的莖人藥 ， 我國76種石斛屬植物中有30多種作為藥用，著名的有鐵皮石斛、金釵石 斛、霍山石斛等， 其具有“ 滋陰養(yǎng)胃、清熱生津、潤肺止咳、明目強身”之功效，神農(nóng)本草經(jīng)將其列為上品，被譽為“ 中華九仙草”之首。藥用石斛的有效成分主要是生物堿和多糖。現(xiàn)代藥理研究表明， 石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集、有效減輕肝損傷等作用，對眼科疾病也有明顯的治療作用。但由于石斛對環(huán)境的要求十分嚴格，自然條件下 ，種子萌發(fā)率極低，生長極緩慢， 再加上過

8、度采挖及環(huán)境的惡化，藥材資源日趨枯竭。為保護利用這一珍稀中藥材， 增加產(chǎn)量，不少學者進行了石斛組織培養(yǎng)快速繁殖研究， 并取得了一定的進展 。但試管苗移栽成活率低， 產(chǎn)量低， 目前還沒能應用試管苗進行大面積栽培，不能滿足藥材市場的需求。因此石斛藥源一直處于相當 緊張狀態(tài)， 亟待解決6,7. 應用現(xiàn)代生物技術和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術來解決才是長遠之計，本文以藥用石斛的分子生物學在提高其有效成分石斛堿這一方面作一介紹。 石斛堿為石斛主要藥用有效成分之一 ，目前已能進行人工合成， 但人工合成成本很高。因此石斛堿相關功能基因的獲得，為下一步通過基因工程大量生產(chǎn)石斛堿奠定基礎。研究人員利用理化因子定向誘導鐵皮石斛種

9、胚原球莖已經(jīng)獲得穩(wěn)定的石斛堿缺失的突變體；運用 cDNAAFLP技術、用差異顯示對突變體表達進行分析；以 mRNAcD A克隆法構(gòu)建鐵皮石斛差減cDNA文庫；以獲得的差異表達的mRNA的反義基因構(gòu)建相應的載體， 轉(zhuǎn)化石斛，分析轉(zhuǎn)基因石斛的成分石斛堿的變化，對反義基因進行篩選 ，確定石斛堿功能基因； 并進行基閃的全長克隆，從而獲得石斛堿相關功能基因這些都為有效利用、開發(fā)、保護及開拓石斛資源創(chuàng)造條件。 Yang H H等從石斛中分離出了色素合成基因，并得到了高效表達。Kuehnle H 等用帶有植物表現(xiàn)NosNPrr基因和番木瓜病毒(PRV)膜蛋白(CP)基因的質(zhì)粒 pGA482 G G cpP

10、RV4包被的微粒轟擊石斛的原球莖進行基因轉(zhuǎn)移實驗。通過4次雜交得到的近2 8 0個原球莖被粒子轟擊，轉(zhuǎn)化與否表現(xiàn)在組織是否變綠。培養(yǎng)基為 12 MS+2 蔗糖 +( 5 0 01 0 0 )mg L硫酸卡那霉素。PCR分析表明，由2次雜交得到了13株具有卡那霉素耐受性植株帶有 Nos NPrr 基因，而只有1株帶有 PRVCP基因。這些結(jié)論表明用粒子轟擊的方法可以實現(xiàn)單子葉植物石斛的轉(zhuǎn)基因。此外，石斛屬植物轉(zhuǎn)基因組織和植物的篩選還可用熒光素酶基因做為標記。Chia等 用帶有 35Sluc嵌合基因質(zhì)粒包被的鎢顆粒u m) 轟擊石斛的原球莖，3周后，向轉(zhuǎn)化組織中 加入 1 mmoL的熒光素，轉(zhuǎn)化細

11、胞可通過低光視頻顯微鏡及其輔助圖像處理設備檢測生物性發(fā)光辨別。將轉(zhuǎn)化的組織切割下來培養(yǎng)生長，然后進行第2輪篩選。這樣經(jīng)過 3輪的生長和篩選后，表達熒光素酶的組織表明基因在該組織中轉(zhuǎn)化成功。同時Southern雜交也證明熒光素酶基因已結(jié)到植物基因組，該方法也可用于其他植物基 因轉(zhuǎn)化的檢測。除了用粒子轟擊的方法來進行石斛原球莖轉(zhuǎn)基因的研究外，有關石斛的研究還涉及了農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因。利用根癌農(nóng)桿菌 Agrobacterium rhizogenes 侵染宿主植物受傷部位的細胞并產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化毛狀根，與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)技術相比，轉(zhuǎn)化毛狀根具有生長迅速、傳性狀穩(wěn)定及激素自養(yǎng)型等特點，克服了植物細胞培養(yǎng)中對原

12、植物激素的依賴性，是生產(chǎn)次塵代謝產(chǎn)物較理想的組織。農(nóng)桿菌侵染植物的關鍵之一是細菌侵入性基 因誘導物的作用 ，誘導物在轉(zhuǎn)化過程中可將 T DNA的加下和轉(zhuǎn)運通道激活，誘導Vir區(qū)基因的活化表達。在雙子葉植物中，許多天然酚性化合物如乙酰丁香酮、 香豆醇和芥子醇等都是已知的細菌侵入性基因的誘導物。但在石斛中，還沒有發(fā)現(xiàn)這類誘導物質(zhì)。Nan研究發(fā)現(xiàn)石斛組織培養(yǎng)中原球莖發(fā)育早期有大量的松柏醇產(chǎn)生，可誘導毒性基因的表達。如果將在暗處培養(yǎng)的原球莖轉(zhuǎn)入光照條件下，其含量呈6倍增加。原球莖松柏醇的產(chǎn)量是葉的11倍，這使通過農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因植物，即將克隆的花色基因、主要藥用成分表達基因等通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入

13、石斛原球莖成為可能。但是農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因在石斛中并未取得成功，這個研究結(jié)果提示農(nóng)桿菌對單子葉植物石斛的不敏感性可能存在著新的機制。以上主要是以利用分子生物學中常用的粒子轟擊和農(nóng)桿菌介導的技術與原理使石斛中控制石斛堿的基因得到高效表達，從而達到提高石斛中有效成分石斛堿含量的目的。分子生物學在基因水平下來提高藥材的有效化學成分是獲得優(yōu)質(zhì)藥材的有效途徑，隨著技術的不斷更新與進步，相信此方法在不久的將來將會得到廣泛的利用。參考文獻1.陳士林，蘇鋼強等中國中藥資源可持續(xù)發(fā)展體系構(gòu)建J中國中藥雜志，30(15)：1141.2.崔光紅，陳敏，黃璐琦等藥用肉蓯蓉的遺傳多樣性RAPD分析J中國中藥雜志，200

14、4，29(8):72.3.范秀娟,郭姣，楊國柱，羅朵生. 分子生物學技術在中藥作用機理研究中的應用J廣東藥學院學報,2007.23(5):592-595.4. 莫雪梅. 分子生物學在中藥研究中的應用現(xiàn)狀探討J. 現(xiàn)代食品與藥品雜志.2006.16(2):75-77.5.李杰芬.分子生物學技術在中藥研究中的應用J.廣州中藥藥大學學報。1996.13（3、4）：97-99。6.張治國,劉驊,王黎等鐵皮石斛原球莖增殖的培養(yǎng)條件研究J.中草藥，1992，23(8)：431.7.郭順星,曹文芩,張集慧等.鐵皮石斛人種子制作流程及發(fā)芽研究J中草藥，1996 27(2)：105.8. 王金發(fā). 細胞生物學.

15、北京：科學出版社，20039. 沈大棱,吳超群. Cell Biology （細胞生物學）. 上海：復旦大學出版社，200610. 桂建芳，易梅生. 發(fā)育生物學. 北京：科學出版社，200211. 特懷曼（R.M.Twyman）著. 王英典等譯. 發(fā)育生物學. 北京：科學出版社，200612. 蔣曉林 ,劉昭陽;中醫(yī)氣學理論與現(xiàn)代分子生物學J;湖南中醫(yī)雜志;2002年06期13. 雷燕;淺談分子生物學技術在中醫(yī)藥研究領域中的應用J;北京中醫(yī)藥大學學報;1998年06期14. 王米渠,吳斌,嚴石林,李煒弘,高泓;從分子生物學的角度探討中醫(yī)藏象學說的內(nèi)涵J;廣州中醫(yī)藥大學學報;2002年04期15

16、. 王建云,付文,范亞剛;細胞與分子遺傳學技術鑒定藥材簡介J;中國藥事;1998年06期16. 陳蘇紅,王小紅,王升啟;中藥影響細胞基因表達的研究進展J;中國中藥雜志;2000年09期17. 周海鈞;21世紀新藥研究與開發(fā)的展望J;中國新藥雜志;2000年01期18.Yang HH，Chua NHIsolation and characterization of genes involved in the pigment biosynthesis of orchids C Proceedings of 13 World Orchid Conference，199048-5019.Kuehnle AR，Cheng S，Zhang G,et al， Transformation of Dendrobium or chid using particle bombardment of protocormsJPlant Cell Repots，1992，11(9)：484-499.20.Chia TF，Giford DJ，Gou XP，et a1The firefly lucifera