刺參微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記的分離及篩選_圖文

1、第 21卷第 2期 大 連 水 產(chǎn) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào)Vol . 21No . 22006年 6月JOURNAL OF DAL I A N F I SHER I ES UN I V ERSI TYJun. 2006文章編號(hào) :1000-9957(2006 02-0095-05刺參微衛(wèi)星 D NA 分子標(biāo)記的分離及篩選丁 君 , 曹 潔 , 李 潤 玲 , 孫 效 文 , 常 亞 青(大連水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 , 遼寧 大連 116023摘要 :采用磁珠富集法分離刺參A postichopus japonicus 的微衛(wèi)星分子標(biāo)記 , 共獲得陽性克隆 123個(gè) ,

2、其中 106個(gè)含微衛(wèi)星 DNA 序列 。 分析結(jié)果表明 :完美型有 48個(gè) , 占 45128%, 非完美型有 39個(gè) , 占36179%, 復(fù)合型有 19個(gè) , 占 17192%; 重復(fù)堿基數(shù)以雙核苷酸重復(fù)最常見 , 占 841, 雙核苷酸中又以 C A /GT重復(fù)所占比例最大 ; 在重復(fù)次數(shù)方面 , 310 35次最為 常見 , 各占 39162%、 26142%和 16198%, 重復(fù)數(shù)達(dá) 5個(gè) , 次 , 有 28個(gè)微衛(wèi)星序列微衛(wèi)星含量豐富 。 篩選的 2217對 , 其中 16對引物 的產(chǎn)物帶在預(yù)測區(qū)域內(nèi)出現(xiàn) ; 有 7。 文中還對刺參微 衛(wèi)星的特點(diǎn)進(jìn)行分析 。:; Q751文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)

3、碼 :A微衛(wèi)星 DNA (M icr osatellites DNA 是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸 (16個(gè) 為單位多次重復(fù)的簡單序 列 。 微衛(wèi)星廣泛存在于真核生物基因組中 , 作為第二代分子標(biāo)記手段 , 微衛(wèi)星分子標(biāo)記以其等位基因 突變快 、 多態(tài)性高 、 雜合度大 、 信息含量豐富 、 呈共顯性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于譜系分析 、 群體遺傳研 究 、 個(gè)體親緣關(guān)系鑒定 、 遺傳病鑒定 、 分子進(jìn)化和生物遺傳作圖等方面 。在水產(chǎn)動(dòng)物方面 , 李琪等1-2應(yīng)用雜交選擇法分離出 8對皺紋盤鮑微衛(wèi)星標(biāo)記 , 并采用磁珠富集法對長牡蠣的微衛(wèi)星克隆進(jìn)行快速分離 ; 孫效文等 3采用小片段法和磁珠吸附法獲得了普通鯉

4、的微衛(wèi)星序列并進(jìn)行了分析 ; 魯翠云等 4采用經(jīng)典生物學(xué)方法獲得了 82個(gè)鳙的微衛(wèi)星序列 , 并通過 Pri m 2er 510軟件設(shè)計(jì)引物 65對 。微衛(wèi)星 DNA 分子標(biāo)記的關(guān)鍵技術(shù)在于根據(jù)微衛(wèi)星的兩翼序列設(shè)計(jì)出適用的引物 。本試驗(yàn)中 , 作 者采用磁珠富集法分離刺參 A postichopus japonicus 的微衛(wèi)星序列 , 并對其進(jìn)行分析和初步篩選 , 以期 為刺參群體遺傳標(biāo)記研究和良種選育提供有力的分子遺傳學(xué)研究工具 。 鑒于微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列保 守性較高 , 刺參的微衛(wèi)星引物也可應(yīng)用于其他相關(guān)經(jīng)濟(jì)棘皮動(dòng)物的遺傳多態(tài)性分析 。1 材料和方法111 材料試驗(yàn)用刺參采自大連獐子島

5、附近海域 , 為野生刺參 , 體重為 150220g 。 112 刺參基因組 DNA 片段的制備及純化取刺參肌肉組織 011g, 加裂解液在 37 下過夜消化 , 用 (酚 (氯仿 (異戊醇 =25 24 1混合液抽提兩遍 , 透析后用無水乙醇沉淀 , 再用體積分?jǐn)?shù)為 70%的乙醇清洗 , 自然干燥后溶于 011 收稿日期 :2006201210 基金項(xiàng)目 :國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (30200212 ; 大連市科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目 (990528 作者簡介 :丁君 (1973- , 女 , 副研究員。 E -mail:dingjun1119dlfu 1edu 1cn 通訊作者 :常亞青 ,

6、 男 , 教授。 E -mail:yqchangdlfu 1edu 1cn ×TE 的緩沖液中 。 取 5g 的刺參基因組 DNA , 經(jīng) 1012U 的 Sau3A I 限制性內(nèi)切酶酶切 , 用試劑盒 回收 400900bp 的刺參基因組 DNA 片段備用 。113 基因組 DNA 片段同接頭的連接11311 接頭的制備 將兩組寡核苷酸等比例混合 , 使每組的終濃度為 25mol/L,降溫條件下進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 , 最終形成的接頭為 : left 5 G AT CGTCG ACGGT ACCG AATT CT right 3 CAGCTGCCATGGCTT AAG AACTG11

7、312 接頭與片段的連接 建立 20L 的反應(yīng)體系 , 即加入接頭 10L, T 4DNA 連接酶 1L, 連接 緩沖液 2L, 刺參基因組 DNA 片段 2L, 加水至 20L 。 在 16 下連接 , 用旋離柱 (由 P ALL F I L 2 TRON 公司生產(chǎn) 離心 , 去除未連接上的接頭 , 最終將產(chǎn)物濃縮至 15L, 然后用 10g/L的瓊脂糖凝 膠電泳檢測接頭是否被去除干凈 , 連接產(chǎn)物是否存在 。114 創(chuàng)建刺參基因組 PCR 文庫以上述得到的連有接頭的 DNA 片段為模板 , , PCR 擴(kuò)增 。反應(yīng)條 件為 :94 下預(yù)變性 3m in, 94下變性 1in, 下 反應(yīng) 1

8、m in, 如此進(jìn)行 20個(gè)循環(huán) , 最后在 72 下延伸 10dNTP, 最終將產(chǎn)物濃縮至 15L 左右 , 然后用 。115 、 富集和捕獲11511 雜交 建立 50L 反應(yīng)體系 , 即加入 10mol/L的探針 115L, 50mol/L的 Pri m er B 5L, 20×SSC 15L, 100g/L的 S DS 015L, 無菌水 16L, 混合均勻后在 68 下預(yù)熱 。 將 “ 114” 節(jié)中 獲得的產(chǎn)物 12L 在 95 下變性 , 然后加入預(yù)熱的雜交混合液中 , 68 下雜交 1h 。11512 磁珠的平衡 將磁珠輕輕搖勻 , 吸出 100L 加入 500L 硅

9、化的離心管中 , 放在磁力架上靜 置 12m in, 將溶液小心吸盡 。 沿著磁珠的一側(cè)加入 200L B&W 洗液洗滌 2次 , 再用 200L 洗液 I 洗滌平衡 3次 , 室溫下靜置 。11513 磁珠的吸附富集和捕獲 將雜交液加入已平衡好的磁珠中 , 25 下輕搖 20m in, 待生物素標(biāo) 記的探針和磁珠充分結(jié)合后 , 再通過磁珠吸附將微衛(wèi)星序列篩選出來 。 具體方法是 :溫育結(jié)束后 , 將 離心管放在磁力架上靜置 12m in, 吸出上清液 。依次用洗液 I 、 洗液 II 、 011×TE 洗滌 , 除去一些 非特異性結(jié)合 。 加入 30L 011×T

10、E, 95 下變性 10m in , 待釋放出含有微衛(wèi)星序列的單鏈 DNA 后 , 再放在磁力架上利用磁力將微衛(wèi)星片段吸出 。116 用 PCR 擴(kuò)增已捕獲的微衛(wèi)星片段進(jìn)行第二次 PCR 反應(yīng) , 擴(kuò)增已捕獲的微衛(wèi)星片段 , 反應(yīng)條件同第一次富集前的 PCR, 并進(jìn)行濃 縮和電泳檢測 。117 DNA 片段與載體的連接和轉(zhuǎn)化建立 10L 反應(yīng)體系 , 即加入 2×連接酶緩沖液 5L, pGE M -T vect or 1L, DNA 片段 2L, T 4DNA 連接酶 1L (3U /L , 無菌水 2L, 同時(shí)要建立一個(gè)自身連接 T -vect or 作為對照 。 4 下 連接過夜

11、 , 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入已制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中 。118 二次篩選將菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素雜交膜和無膜的 LB 瓊脂板上 , 用無膜的瓊脂板作為主板 , 以備挑取陽 性克隆 。 用 -32P 標(biāo)記的 (CA 15探針進(jìn)行雜交 24h, 放射自顯影 7d, 得到的陽性克隆在北京諾賽 基因組研究中心有限公司進(jìn)行序列測定 。119 PCR 擴(kuò)增利用中國和俄羅斯刺參的基因組 DNA 作為模板 , 用設(shè)計(jì) 、合成的 22對微衛(wèi)星引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò) 69大 連 水 產(chǎn) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào) 第 21 卷增 , 每對引物的最適退火溫度通過溫度梯度 PCR 試驗(yàn)得到 。 PCR 反應(yīng)條件為 :94 下變性 5m

12、 in, 經(jīng) 35個(gè)擴(kuò)增循環(huán) , 每一循環(huán)包括 94 下變性 1m in, 退火 1m in, 72 下反應(yīng) 40s, 最后在 72 下 延伸 10m in 。 擴(kuò)增產(chǎn)物用 15g/L瓊脂糖凝膠電泳分離 , 用 EB 染色 , 然后用凝膠成像儀觀察并拍照 。2 結(jié)果211 刺參微衛(wèi)星 DNA 的測序及分析本試驗(yàn)中 , 共挑取轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落 1769個(gè) , 用 pGE M -T vect or 自連作為對照 , 可知有 1/3的菌落為空載體轉(zhuǎn)入 , 即有 1185個(gè)菌落為重組子 。 采用經(jīng) -32P 標(biāo)記的探針進(jìn)行二次篩選 , 最終測 序得到陽性克隆 123個(gè) , 其中有 106個(gè)含微衛(wèi)星序

13、列 (部分微衛(wèi)星序列已在 GenBank 上注冊 。根據(jù) 微衛(wèi)星核心序列排列方式 , 可將 106個(gè)微衛(wèi)星序列分為 3類 :1 完美型 (Perfect 有 48個(gè) , 占 45128%;2 非完美型 (I m Perfect 有 39個(gè) , 占36179%; 3 復(fù)合型 (Compound 有 19個(gè) , 占 17192%。從表 1可見 , 重復(fù)堿基數(shù)以雙 核 苷 酸 重 復(fù) 最 為 常 見 , 占 84191%, 其中又以 /占比例較大 ; , 以 重復(fù)數(shù)為 31118次和 35次最為常見 , 各占 39162%、 26142%和 16198%, 重復(fù)次 數(shù)達(dá) 100次以上的有 5個(gè) ,

14、最多的達(dá)到 148次 。 試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn) , 有 28個(gè)序 列中所含微衛(wèi)星數(shù)豐富 (對于含 微衛(wèi)星數(shù)豐富的序列 , 取其中重復(fù) 次數(shù)最多的微衛(wèi)星序列進(jìn)行各項(xiàng)統(tǒng) 計(jì) 。在 106個(gè) 微衛(wèi) 星序 列 中 , 有 12個(gè)序列因位置原因或序列本身 問題無法設(shè)計(jì)引物 , 其余都可以根 據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列用 Pri m er 5軟 件設(shè)計(jì)出引物 , 表 2是其中得分較 高 、 微衛(wèi)星重復(fù)序列較多 、 產(chǎn)物長 度小于 300bp 、無發(fā)卡結(jié)構(gòu)的 30對引物的序列情況分析 。212 刺參微衛(wèi)星引物的初步篩選 結(jié)果從表 2列出的 30對引物中選 出 22對引物送到上海申工生物制 品公司合成 , 對設(shè)計(jì) 、 合成的

15、微衛(wèi) 星引物進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化 , 然后對 每對引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 , 并用瓊 脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測 。 其初步篩 選結(jié)果為 :在篩選的 22對引物中 ,表 1Tab 11 The ana lysis of m i a tellite postichopus japon icus重復(fù)堿基數(shù) /個(gè)Repeated base number/number數(shù)量Numbers百分比 /% Percent 3104239. 623. 7711182826. 42476. 6019261211. 32 510. 94273465. 66 643. 77 351816. 98表 2 刺參微衛(wèi)星引物序列的分析

16、Tab 12 The ana lysis of m i cros a tellite pr i m ers i n A postichopus japon icus 序列號(hào)No .產(chǎn)物大小 /bpPr oduct size退火溫度 /Ta Op t重復(fù)序列Repeated sequence微衛(wèi)星序列分類 M icr osatellite type 12054916(GT 17Perfect 22795319(GT 17Perfect 31705710(GT 6Perfect 42695315(CA 118Perfect 52444913(CA 46Perfect 62645317(CA 7Pe

17、rfect 71665118(GT 5Perfect 81564418(GT 17Perfect 91574717(GT 14Perfect 102285015(CA 12Perfect 112185011(CA 13Perfect 121935018(CA 5Perfect 131205213(CT 6Perfect 14278 5211(CT 7Perfect 152635017(G A 38Perfect 162635312(TG 4Perfect 171435617(GT 4Perfect 182175416(CA 7(CA 9Perfect 191565016(CA 9(CA 7(C

18、A 9Perfect 201124915(CA 9(CA 7(CA 8Perfect 211225311(CA 4CG (CA 3CG (CA 5I m perfect 221975019(CA 10C (CA 8I m perfect 232724910(GT 4AT (GT 7I m perfec 242704917(CA 8C (CA 8I m perfec 251225311(CA 4CG (CA 3CG (CA 5I m perfect 261205114(CA 18CG (CA 6I m perfec 272475310(CA 21(CT 10Compound 282585512(

19、CA 7CG (CA 14CA (G A 8Compound 292564819(CA 27(CAT A 40Compound 302445117(GT 6(G A 8(GT 11Compound 79第 2期 丁君 , 等 :刺參微衛(wèi)星 DNA 分子標(biāo)記的分離及篩選可產(chǎn)生出擴(kuò)增產(chǎn)物的有 17對 , 除 1對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 7501000bp, 其他 16對引物的產(chǎn)物帶均在預(yù)測區(qū)域內(nèi)出現(xiàn) , 其中有 9對引物在所有模板中都出現(xiàn)單一條帶 , 有 7對引物在中國 、 俄羅斯刺 參模板中表現(xiàn)出多態(tài)性 (圖 1。 圖 1 刺參微衛(wèi)星引物初步篩選擴(kuò)增結(jié)果F i g 11 The screen i

20、n g result of m i cros a tellite marker of sea m icus 注 :10個(gè)個(gè)體分別來自中國養(yǎng)殖刺參 (C1C5 R5 , 。3 討論311 自 20世紀(jì) 80年代中期以來 , 微衛(wèi)星標(biāo)記開始受到廣泛關(guān)注 , 研究者大多采用傳統(tǒng)的直接雜交篩 選法分離微衛(wèi)星 , 該方法對于基因組中含量不是很豐富的微衛(wèi)星序列分離較困難 。 隨后 , 國外又陸續(xù)報(bào)道了引物伸長法 (Pri m erextensi on 、 雜交選擇法 (Hybridizati on Selecti on 、以 RAP D 為基礎(chǔ)的 PCR 法和 F I A SCO 法 (Fast Is o

21、lati on by AF LP of Sequences Containing Repeats 4種微衛(wèi)星分離技術(shù) 。 磁珠富 集法是 1994年 Kijas 5提出的一種比較快速分離較長微衛(wèi)星序列的方法 , 這種方法是基于磁珠表面的 鏈霉親和素與標(biāo)記于微衛(wèi)星探針上的生物素之間的共價(jià)結(jié)合原理而建立起來的 , 該方法能在短時(shí)間內(nèi) 對潛在的數(shù)百個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行分離 , 對于微衛(wèi)星序列含量低的生物尤其適用 。 另外 , 用磁珠吸附法 獲得的微衛(wèi)星克隆在高重復(fù)次數(shù)的比例上較經(jīng)典方法高 , 而重復(fù)次數(shù)高的微衛(wèi)星序列在群體分析中表 現(xiàn)出的多態(tài)性也較高 , 因此 , 磁珠富集法是一種值得推薦的微衛(wèi)星制備方

22、法 。李琪等2通過磁珠吸附法獲得的長牡蠣微衛(wèi)星序列中 , 完全型占 5417%, 非完全型占 2018%,復(fù)合型占 2415%; 曹潔等 6獲得的鮑魚微衛(wèi)星序列中 , 完美型占 5818%, 非完美型占 2814%, 復(fù)合型占 1217%, 本試驗(yàn)結(jié)果與長牡蠣及鮑魚等軟體動(dòng)物的微衛(wèi)星序列特點(diǎn)基本相似 。對于微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)與多態(tài)性的關(guān)系眾說不一 。 Panaud 等7認(rèn)為 , 微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)的多少與多態(tài)性之間不存在相關(guān)性 , 多數(shù)學(xué)者則認(rèn)為微衛(wèi)星重復(fù)次數(shù)與多態(tài)性之間呈正相關(guān) , Ma 8認(rèn)為 , 微衛(wèi)星 的核心序列重復(fù)數(shù)越高 , 其等位基因數(shù)也就越多 , 即多態(tài)性也就越高 。 S mulders

23、9認(rèn)為 , 重復(fù)次數(shù)多 的微衛(wèi)星既能在種間又能在種內(nèi)產(chǎn)生多態(tài)性 , 而重復(fù)次數(shù)少的微衛(wèi)星 , 僅能在種間產(chǎn)生多態(tài)性 。 無論 重復(fù)次數(shù)多少 , 種間的多態(tài)性檢測要易于種內(nèi)的多態(tài)性檢測 , 并且種內(nèi)個(gè)體的遺傳距離越遠(yuǎn) , 多態(tài)性 則越豐富 。 Valdes 等10認(rèn)為 , 在人類中采用重復(fù)次數(shù)低于 5的微衛(wèi)星設(shè)計(jì)的引物 , 幾乎檢測不出多態(tài)性 。 因此 , 一個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星長度是預(yù)測該位點(diǎn)多態(tài)性水平的重要參數(shù) 。為了得到更高的多態(tài)性 , 在選擇合成引物時(shí) , 要將重復(fù)次數(shù)這一指標(biāo)考慮在內(nèi) 。 相關(guān)研究表明 , 真核生物的微衛(wèi)星長度大部分 都在 30次重復(fù)以下 , 長牡蠣中約有 71117%的微衛(wèi)

24、星重復(fù)序列低于 30次 2, 而鮑魚中約有 7715%的微衛(wèi)星重復(fù)序列低于 30次6, 本試驗(yàn)中刺參的微衛(wèi)星 DNA 的重復(fù)數(shù)低于 26次的占 77136%, 與鮑魚和長牡蠣中微衛(wèi)星 DNA 重復(fù)次數(shù)所占的比例接近 。本研究中微衛(wèi)星重復(fù)單元除探針中的 CA /GT 外 , 還觀察到 CAT A 、 CT 、 CCA 、 G A 、 CACT 、 CAA 、 CACAG A 重復(fù) , 試驗(yàn)中得到的這些有關(guān)微衛(wèi)星組成和長度的分布數(shù)據(jù)可以為分離其他棘皮動(dòng)物微衛(wèi)星選擇適宜重復(fù)單元提供幫助 。 312 刺參微衛(wèi)星引物的 PCR 初步篩選結(jié)果分析本試驗(yàn)結(jié)果表明 , 可將刺參微衛(wèi)星引物的 PCR 篩選分析分

25、為 3種情況 :1 沒有擴(kuò)增產(chǎn)物 ; 2 擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期產(chǎn)物的長度不一致 (有 1條引物存在這種情況 , 這可能是由于基因組中存在一些序 列與設(shè)計(jì)的引物發(fā)生錯(cuò)配 , 使一些不是微衛(wèi)星序列的基因組 DNA 得到擴(kuò)增 , 引起產(chǎn)物的大小發(fā)生變 化 ; 3 只在部分個(gè)體中出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物 (有 2對引物出現(xiàn)此種現(xiàn)象 , 可能是微衛(wèi)星引物的結(jié)合位點(diǎn) 處在該基因的可變區(qū) , 有些個(gè)體的基因在此位置出現(xiàn)變異 , 導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的改變或喪失 , 結(jié)果無 法擴(kuò)增出產(chǎn)物 。 本試驗(yàn)初步篩選出的微衛(wèi)星序列可應(yīng)用于下一步刺參的遺傳分析中 。參考文獻(xiàn) :1 L IQ, P ARK C, K OBAY ASH I T,

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