DNA的分離純化及測定

1、第一章 DNA的分離、純化及測定第一節(jié) DNA的提取 一、提取程序的原理植物DNA的提取程序應(yīng)包括以下幾項；1，破碎(或消化)細(xì)胞壁釋放出細(xì)胞內(nèi)容物。然而許多操作在破壁的同時也會剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和產(chǎn)量這兩個方面之間折衷考慮的結(jié)果。分離總基因組DNA常用的破壁方法是將植物組織脹水，然后研磨成細(xì)粉，或者將新鮮植物組織在干冰或液氮中快速冷凍后，用研缽將其磨成粉。分離核DNA或細(xì)胞器DNA時則應(yīng)采取較為溫和的破壁方法，以免過早破壞內(nèi)膜系統(tǒng)，人們通常采用在含有滲透劑的緩沖液中4oC勻漿的方法來破壁。 2、破壞細(xì)胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中。這一步驟通常靠諸如SDS或CTAB

2、一類的去污劑來完成。去污劑還可以保護(hù)DNA免受內(nèi)源核酸酶的降解。通常提取緩沖液中還包含EDTA，它可以螯合大多數(shù)核酸酶所需的輔助因子鎂離子。3、去除RNA、蛋白質(zhì)、多糖、丹寧和色素等雜質(zhì)一旦DNA釋放出來，其剪切破壞的程度必須要降到最低。劇烈振蕩或小孔快速抽吸都會打斷溶液中高相對分子質(zhì)量的DNA 。一般說來，如果操作得當(dāng)，可以得到相對分子質(zhì)量長度為50l00kb的DNA。在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白質(zhì)、多糖、丹寧和色素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)有時很難從DNA中除去。大多數(shù)蛋白可通過氯仿或苯酚處理后變性、沉淀除去，絕大部分RNA則可通過經(jīng)處理過的RNase A除去。但多糖類雜質(zhì)一般較難去除，

3、這些雜質(zhì)濃度高時，常常使DNA提取物呈膠狀，更為重要的是即使是低濃度情況下它們也會干擾后續(xù)操作，如抑制某些DNA修飾酶包括限制性內(nèi)切酶的活性，從而阻礙Southern雜交或基因克隆；同時多糖雜質(zhì)還會影響分光光度法對核酸的定量分析等。（植物分子生物學(xué)-實驗手冊 （英） Clarke M. S. 主編 顧紅雅 瞿禮嘉 主譯 高等教育出版社 1998 ）二、基因組DNA的提取1、基因組DNA用途DNA是遺傳信息的載體，是重要的生物信息分子, 是分子生物學(xué)研究的主要對象。為了進(jìn)行測序, Southern雜交|, 基因文庫的構(gòu)建，PCR擴(kuò)增等，高分子量和高純度的基因組DNA是非常重要的前提. 2、基因組

4、DNA提取的原則保證提取的DNA具有一定的長度純化后不應(yīng)存在對酶有抑制作用的物質(zhì)排除有機(jī)溶劑和金屬離子的污染蛋白質(zhì),多糖,脂類等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染 3、基因組DNA- CTAB法 CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)CTAB( hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨), 是一種陽離子去污劑, 具有從低離子強(qiáng)度 (0.3mol/L NaCl) 溶液中 沉淀核酸與酸性多聚糖的特性, 在高離子強(qiáng)度的溶液中( >0.7mol/L NaCl), CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物, 只是不能沉淀核酸. 通過有機(jī)溶劑抽提,

5、 去除蛋白, 多糖, 酚類等雜質(zhì)后 加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 Tris-HCl（三(羥甲基)氨基甲烷）(pH8.0) 提供一個緩沖環(huán)境, 防止核酸被破壞; EDTA 螯合Mg2+ 或Mn2+ 離子, 抑制DNase活性; NaCl 提供一個高鹽環(huán)境, 使DNA充分溶解, 存在于液相中; CTAB溶解細(xì)胞膜, 并結(jié)合核酸, 使核酸便于分離; -巰基乙醇 是抗氧化劑, 有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物, 能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除 多酚, 減少DNA中酚的污染; 同時它也能

6、和多糖結(jié)合,有效去除多糖. ( From web modified )方法1液氮1×緩沖液： 50 mmol /L Tris-HCl pH 8.0 ,0.7mol /L NaCl,10 mmol /L EDTA pH 8.0 ,1% CTAB,20 mmol /L 2-巰基乙醇（用前加入）氯仿/異戊醇（24：1） RNaseA : 2000U / mL 用0.15 mol/L NaCl, 0.015 mol/L 檸檬酸三鈉配10mg/mL; 使用前100 熱處理15min , 除去殘留的DNase活性異丙醇，76%乙醇，0.2 mol/L乙酸鈉70%乙醇TE緩沖液: 10 mmol/

7、L Tris-HCl 1 mmol /L EDTA pH 8.0 ,操作程序1. 向裝有700800 mg 磨碎的 干燥植物組織 （ 冰凍干燥法， 或用食品脫水器45 55用溫暖干燥的氣流對植物組織處理12h 以上）（最好是去淀粉處理的：收獲之前將植株暗處理24 h）的50mL聚丙烯離心管中加入20mL 65 預(yù)熱的1×CTAB提取緩沖液。輕輕轉(zhuǎn)動離心管使植物組織在提取緩沖液中均勻分散，65 溫育90min, 并不時輕輕轉(zhuǎn)動離心管。 或者， 將10g 經(jīng)去淀粉處理的新鮮植物材料用液氮速凍，然后在研缽中將其磨碎，在化凍之前將粉末轉(zhuǎn)移至一50mL聚丙烯離心管中，然后加入20mL 預(yù)熱至9

8、0的2×CTAB提取緩沖液（CTAB在低于15時會析出沉淀，因此在將其加入到冷凍的材料中之前必須預(yù)熱）。輕輕轉(zhuǎn)動離心管，混勻，然后置于65 溫育90min。2混合物冷至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇。輕輕顛倒離心管幾次使管內(nèi)混合物成乳濁液。室溫下5000 g 離心10 min分相。3將上清液（水相）轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入1/100體積RNaseA貯液，顛倒混勻37保溫30min。4加入0.7體積異丙醇，仔細(xì)混勻，室溫放置15min沉淀DNA。5用一玻璃鉤將DNA鉤出（最適條件下，DNA-CTAB沉淀呈白色纖維狀，很易鉤出，若有多糖等雜質(zhì)時呈絮狀或膠狀，需離心得到DNA-CTAB沉

9、淀；2% W/V PVP聚乙烯吡咯烷酮 有助于去除多酚類雜質(zhì)），并轉(zhuǎn)移至一裝有5mL 76%乙醇，0.2 mol/L乙酸鈉的干凈離心管中，冰上放置20min，然后轉(zhuǎn)移至一裝有5mL 76%乙醇的離心管中冰上旋轉(zhuǎn)5min。 6將DNA轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，空氣干燥15min ，溶于盡可能少的TE緩沖液中（5 mL左右）。若要使DNA樣品加速溶解并除去其中殘留的DNase活性，可置于 65 水浴加熱10min。4貯存。（植物分子生物學(xué)-實驗手冊 （英） Clarke M. S. 主編 顧紅雅 瞿禮嘉 主譯 高等教育出版社 1998 ）方法2CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium

10、 Bromide 十六烷基三甲基溴化銨)是一種去污劑它能跟核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鹽溶液(0.7mol/L NaCl)中可溶并且穩(wěn)定存在、但如果降低鹽的濃度(0.3mol/L NaCl)，CTAB與核酸的復(fù)合物就會因溶解度降低而沉淀出來。而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中，通過離心將 CTAB- 核酸沉淀下來，然后溶于高鹽溶液中，最后通過CsCl離心去除所有蛋白、多糖、寡聚核苷酸等不純物。抽提緩沖液（2×） CTAB ( W/V) 2% Tris-HCl(pH 8.0) 100mmol/l EDTA 20mmol/l NaCl 1.4mol/l 巰基乙醇 2%10% CTAB溶液

11、NaCl 0.7mol/l CTAB 10% 沉淀緩沖液CTAB 1%Tris-HCl(pH 8.0) 50mmol/lEDTA 10mmol/l 巰基乙醇 1% CsCl梯度溶液（每梯度） CsCl 25gTE緩沖液( pH 8.0) 25ml溴化乙錠（(EB) 5mg/mlTE緩沖液: Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA 1 mmol /L 異丙醇溶液：向裝有一定量異丙醇的瓶中加入TE緩沖液直至兩相出現(xiàn)，然后邊攪拌邊加入固體CsCl，至下層TE相中出現(xiàn)白色沉淀，兩相均勻待用液氮 氯仿/異戊醇（24/1）異丙醇2%巰基乙醇氯仿還能加速有機(jī)相與液相分層。去除植物色

12、素和蔗糖在氯仿中加入少許異戊醇的目的在于減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生氣泡。最后用氯仿抽提處理，是為了去除核酸溶液中的跡量酚。實驗程序（1） 取10g50g 新鮮植物材料，先置液氮中速凍半分鐘，轉(zhuǎn)至研缽中研磨成細(xì)粉末。（2） 將細(xì)粉末轉(zhuǎn)至一個250ml的離心管中，先加入1050ml的2%巰基乙醇，再加等體積的煮沸的抽提緩沖液（2×），迅速混勻。（3） 將離心管置55 水浴中保溫，可輕輕攪動混合物，使離心管內(nèi)溫度達(dá)到50 ，然后讓混合物降至室溫。 （4） 加等體積的氯仿/異戊醇（24/1），輕緩地顛倒混勻，室溫下12000 g離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)至另一新離心管中。（5）向離心管中加入1/

13、10體積的10% CTAB溶液， 再重復(fù)第4步一次。（6）向離心管中加入等體積的沉淀緩沖液，混勻，室溫下放置至少30分鐘，4000g離心10分鐘，小心去上清，加CsCl梯度溶液，在50 水浴中用槍頭輕緩攪溶沉淀。（7）將梯度溶液上到超速離心管中，平衡后封好管，在20，50000g條件離心過夜。（8）在紫外燈下轉(zhuǎn)移DNA帶至一離心管中，加入等體積的異丙醇溶液，輕輕混勻后靜置，分層后棄上層；重復(fù)抽提幾次，直至紫紅色消失。（9）加兩倍體積的TE緩沖液，混勻后加等體積的異丙醇，-20放置1小時，4條件下12000g離心30分鐘，沉淀溶于TE緩沖液中。（10）向其中加入1/5體積的3mol/l NaAc

14、(pH6.0)和3/5體積的異丙醇，混勻，在室溫下放置510分鐘，離心后沉淀溶于適量TE緩沖液中。（11）用紫外分光光度儀檢測DNA含量。（8）是去除EB, 異丙醇溶液也可用氯化鈉飽和。 CTAB法提取真菌基因組DNA2×CTAB提取緩沖液 (使用前在 55 or 65oC預(yù)熱)2% (w/v) CTAB (Hexadecyltrimethylammonium Bromide, Sigma # H-5882 =cetyltrimethylammonium bromide)100 mM Tris-HCl (pH 8.0)20 mM EDTA (pH 8.0)1.4 M NaClopti

15、onal: add 1% mercaptoethanol before using (I usually do no add MCE)1 取干菌絲（80oC保存）放入研缽，加液氮后，研磨成粉末。2 將粉末轉(zhuǎn)到離心管中，加入2×CTAB提取緩沖液 (使用前在 55 or 65oC預(yù)熱)。 （1g 加20 ml）。3 65oC保溫30 min4 加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），混勻，輕輕轉(zhuǎn)動20 min。5 4,000 rpm 離心5 min.6 取上清液于另一離心管，加RNaseA（5-50g/ml）37oC保溫30-60 min。7 加入酚：氯仿（1:1)，輕輕來回顛倒5 min

16、. 8 4,000 rpm 離心5 min.4oC。9 加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），輕輕轉(zhuǎn)動5 min。10 取上清液于另一離心管，加入2倍體積100% 乙醇或 0.6-1×異丙醇。11 10,000 rpm離心10 min.4oC 12. 5-10 ml 70% 乙醇洗一次。13 風(fēng)干DNA， 用DDW or TE緩沖液溶解。 三、細(xì)胞核、線粒體、葉綠體DNA的提取 1、細(xì)胞器差速分離： 2、從分離的細(xì)胞核中提取DNA 多酚類或多糖類含量較高的植物而言，用上述基本程序提取的DNA其純度恐難以滿足后續(xù)研究的要求。一個解決辦法就是在裂解之前將細(xì)胞核同其他大部分細(xì)胞質(zhì)分開。下述分

17、離完整細(xì)胞核的方法(Henfrey和Slater l988), 適用于新鮮的植物材料。它包括 選定對核膜傷害最小的條件破碎細(xì)胞，濾去細(xì)胞碎片，濾液經(jīng)緩速離心富集細(xì)胞核。從分離的細(xì)胞核中提取的DNA通常質(zhì)量和純度都較高，其中主要是核DNA，當(dāng)然也可能混有一些細(xì)胞器DNA，特別是葉綠體DNA。從分離的細(xì)胞核中提取DNA，得率較低，一般為1020g/g鮮重材料。核分離緩沖液（NIB）：0.44mol/L 蔗糖，2.5% Ficoll (相對分子質(zhì)量400000)，5% Dextran 40 ，25mmol/L Tris-HCl pH 7.6，10mmol/L氯化鎂，10mmol/L 2-巰基乙醇（用

18、前加入）核裂解緩沖液：10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA, 0.5% Triton X-100, pH7.2. Miracloth 紗布NIB: nuclear isolation bufferFicoll 聚蔗糖 Dextran葡聚糖 Triton x-100 非離子型表面活性劑步驟14中所需的試劑和儀器均須預(yù)冷至4以降低內(nèi)源蛋白酶和核酸酶的活性。1將10 g 經(jīng)去淀粉處理的新鮮材料剪碎，放入研缽中，加入10mL NIB 磨碎勻漿。2勻漿用4倍體積NIB稀釋后經(jīng)雙層Miracloth紗布過濾（Miracloth紗布預(yù)先用NIB浸濕）。用5倍體積NIB沖洗Mirac

19、loth紗布上的殘留物。3濾液分裝于兩個50 mL聚丙烯離心管中， 500g , 4離心10min. 棄上清。4用總體積20 mL NIB 重懸沉淀，合并，500g , 4離心10min. 棄上清。5用6 mL核裂解緩沖液重懸上述細(xì)胞核粗沉淀，加入6 mL預(yù)熱至65的2×CTAB提取緩沖液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，65保溫1h, 偶爾輕輕旋轉(zhuǎn)。6以下操作按基本CTAB方法從第2步開始。去淀粉處理：收獲之前將植株于暗處放置24h即可達(dá)到去除淀粉的目的。（植物分子生物學(xué)-實驗手冊 （英） Clarke M. S. 主編 顧紅雅 瞿禮嘉 主譯 高等教育出版社 1998 ）3、葉綠體DNA的提取 分離

20、植物葉綠體DNA的方法與分離核DNA的方法比較類似也包括以下幾個主要過程：植物細(xì)胞的破碎，去除細(xì)胞核，然后用中速甩下葉綠體，經(jīng)清洗和DNase處理后即可用常規(guī)的沉淀核DNA的方法將葉綠體DNA沉淀下來。 細(xì)胞器分離緩沖液：Sorbitol 300mmol/lTris-HCl (pH8.0) 50mmol/lEDTA 5mmol/lBSA 0.1%-巰基乙醇（V/V） 0.1%DNase緩沖液：Sorbitol 300 mmol/lTris-HCl (pH8.0) 50 mmol/lEDTA 5 mmol/lBSA 0.1%-巰基乙醇（體積比） 0.1%MgCl2 13mmol/lDNase I

21、 250g/ml細(xì)胞器清洗緩沖液： NaCl 150 mmol/lTris-HCl (pH8.0) 50 mmol/lEDTA (pH8.0) 25 mmol/l裂解緩沖液：Tris-HCl (pH7.2) 50 mmol/lEDTA 20 mmol/lSarkosyl溶液： Tris-HCl (pH7.2) 50 mmol/lEDTA 20 mmol/lSarkosyl 20%0.5mol/l EDTA (pH8.0) 52%和30%蔗糖Sorbitol 山梨醇 sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸鈉)是一種比較強(qiáng)的陰離子去垢劑牛血清白蛋白(BSA) 能包在細(xì)胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋

22、白酶的作用。實驗程序 (1) 將一定量的植物葉片剪成小片(愈傷組織切割成小塊)，置于400 ml預(yù)冷的細(xì)胞器分離緩沖液中用勻漿器以中等速度勻漿12分鐘，然后將勻漿液用4層滅菌的紗布和1層Miracloth過濾至一滅過菌的1升燒杯中。 (2) 將過濾后的勻漿液移至離心管中，以700g的速度4條件下離心10分鐘，去沉淀；上清移至另一離心管中，4條件下2000g離心10分鐘，去上清。 (3) 將沉淀懸浮于25ml DNase緩沖液中，冰上放置1小時加0.5mol/l EDTA溶液至終濃度為20 mmol/l，然后在4條件下2000g離心15分鐘。 (4) 將沉淀懸浮于30ml細(xì)胞器分離緩沖液中，待用

23、 (5) 用50ml離心管制4個蔗糖梯度，每一梯度的制法為：底都為18ml的52蔗糖、50mmol Tris-HCl( pH8.0)和25mmol EDTA混合液，上面蓋上7ml 30蔗糖、50mmol Tris-HCl( pH8.0)和25mmol EDTA混合液。 (6) 將第4步中懸浮的沉淀7.5ml小心地分別上于一個梯度離心管中，平衡后以25000 r/min速度在4離心30分鐘。 (7) 用寬口大槍頭從5230蔗糖界面上吸取葉綠體條帶，置于250ml燒杯中。緩緩地用三倍體積的預(yù)冷的細(xì)胞器分離緩沖液稀釋，然后將液體移置適當(dāng)大小的離心管中，4條件下以2000g離心15分鐘。 (8) 沉淀

24、懸浮于25ml細(xì)胞器清洗緩沖液中，4條件下以2000g離心15分鐘。 (9) 將每份沉淀懸浮于5ml裂解緩沖液中，在水上邊搖晃邊滴入20的Sarkosyl溶液，至終濃度為1。 (10) 將裂解的葉綠體上一個CsCl/EtBr密度梯度，即可獲得較純的葉綠體DNA。4、植物線粒體DNA的分離分離植物線粒體DNA，首先就要分離出線粒體，然后再從線粒體中分離DNA。提取的過程主要包括破碎細(xì)胞、差速離心、梯度離心、鹽沉淀等。1 mol/l CsCl/ EtBr溶液CsCl 1 mol/l Tris-HCl (pH8.0) 50mmol/lEDTA 10mmol/lEtBr 0.2mg/ml7mol/l

25、CsCl/ EtBr溶液CsCl 7 mol/l Sarkosyl 0.1%EtBr 0.2mg/mlCsCl 飽和的異丙醇0.5mol/l 的EDTA溶液 (pH8.0)3mol/l NaAc實驗程序:(1) 將一定量的植物葉片剪成小片(愈傷組織切割成小塊)，置于400ml預(yù)冷的細(xì)胞器分離緩沖液中用勻漿器以中等速度勻漿12分鐘，然后將勻漿液用4層滅菌的紗布和1層Miracloth過濾至一滅過菌的1升燒杯中。(2) 將過濾后的勻漿液移至離心管中，以700g的速度4條件下離心10分鐘，去沉淀；上清移至另一離心管中，4條件下2000g離心10分鐘，再去沉淀，上清再移至另一離心管中、4下以10000

26、g速度離心15分鐘，去上清。 (3) 將沉淀懸浮于25ml DNase緩沖液中，冰上放置1小時加0.5mol/l EDTA溶液至終濃度為20 mmol/l，然后在4條件下10000g離心15分鐘。 (4) 沉淀用25ml沖洗緩沖液懸浮并再次在4條件下10000g速度離心15分鐘 (5）沉淀用5ml裂解緩沖液懸浮置冰上然后向其中滴入20的Sarkosyl溶液至終濃度為1，4條件下500g低速離心5分鐘上清移至一離心管中。 (6) 先向離心管中加入一定量的1moll CsCl/EtBr，55水浴中保溫5分鐘，然后加入前者體積1.2倍的7 moll CsCl/EtBr將離心管蓋好封上，緩慢倒置混勻。

27、 (7) 以40000r/min速度在4離心16小時或更長，在320nm紫外光下觀察DNA帶，在DNA帶管壁旁用單面刀片劃一道小口子，然后用帶針頭的注射器穿刺進(jìn)去抽出DNA帶。 (8) 加入等體積的CsCl飽和的異丙醇去除EtBr，水相再置于透析袋中4透析24小時以上2升的去離子水至少換三次并用磁力攪拌器攪拌。 9) 在260nm測A值計算DNA樣品的量。加入0.1體積的3mol/l NaAc和2體積冷的無水乙醇置-20過夜。 (10) 10000rmin離心10分種，沉淀經(jīng)真空抽干后溶于適量體積的水中，電泳檢查。 植物基因與分子操作 顧紅雅 1995年04月第1版四、質(zhì)粒DNA的提取堿變性質(zhì)

28、粒DNA抽提法 堿變性質(zhì)粒DNA抽提法是利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性差異來達(dá)到分離質(zhì)粒DN A的目的的。在強(qiáng)堿條件下染色體DNA氫鍵斷裂雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；質(zhì)粒DNA大部分氫鍵也斷裂，但由于其螺旋共價閉合環(huán)狀的結(jié)構(gòu)兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離、當(dāng)體系的pH從堿性調(diào)至中性時，兩條鏈即復(fù)性，質(zhì)粒DNA即以原來的構(gòu)型保存在溶液中.而染色體DNA不能很快復(fù)性，只能形成纏連在一起的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；這時一離心，染色體DNA就與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS 復(fù)合物等雜質(zhì)一起沉淀下來而被除去。質(zhì)粒DNA在溶液中以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，用乙醇沉淀的方法即可獲得純的質(zhì)粒DNA。如果要提高質(zhì)粒DNA的純度、最好

29、再在提取過程中加上加RNase降解小分子RNA、加苯酚氯仿抽提蛋白和加PEG沉淀等步驟。大致可分為從菌體染色體DNA中分離質(zhì)粒DNA、去除RNA和去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)三大步驟，實驗中采用的各種試劑成分均有其生化功能。溶液I：溶菌酶 用于水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分，具有溶菌作用。葡萄糖 是為了增加溶液粘度，以防止染色體DNA受機(jī)械剪切力作用而降解、污染質(zhì)粒。EDTA 一是抑制DNase對DNA的降解作用，因為EDTA是一種金離子鰲合劑，DNase作用時卻需要一定的金屬離子作輔基；二是保證溶菌酶有一個良好的低離子強(qiáng)度的環(huán)境。溶液II：NaOH 可促使染色體DNA及質(zhì)粒DNA強(qiáng)堿變性。SDS 則是表面

30、活性劑，功能是破壞膜、解聚核蛋白以及形成蛋白質(zhì)變性復(fù)合物以利于沉淀。溶液III KAcHAc緩沖液它使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性并穩(wěn)定存在。 溶液I：葡萄糖 50mmol/lTris-HCl (pH8.0) 25mmol/lEDTA 10mmol/l溶菌酶 4mg/ml溶液II (新配制) ： NaOH 0.2mol/l SDS 1%溶液III （100ml, pH4.8）：KAc 29.4g 冰醋酸 11.5ml水 加至 100mlTE緩沖液: Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA(pH 8.0) 1 mmol /L氯仿/異戊醇（24/1）RNase (10mg/ml)

31、無水乙醇和70%乙醇 異丙醇 4mol /L NaCl 13% PEG8000實驗程序 (1) 取單個細(xì)菌菌落接種到5ml 含有50g/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37過夜。 (2) 取1.5ml × 3培養(yǎng)液至Eppendorf管中，7000g離心2分鐘 ，去上清液。 (3) 將沉淀菌懸浮于200l預(yù)先冷卻的 溶液I 中，混勻后開蓋在室溫下放置5分鐘。(4) 向管中加入300 l新配制的溶液II，蓋上蓋子迅速顛倒小管23次混勻，冰上放置5分鐘。 (5) 加入300l溶液III，蓋上蓋子倒置 溫和振蕩10秒鐘，冰上再放置5分鐘10000rmin條件下離心6分鐘。 6) 上清液轉(zhuǎn)

32、至另一新管中，向管中加入10 l RNase A , 37下保溫30分鐘。 (7) 加等體積氯仿：異戊醇（24:1）抽提兩次12000rmin離心5分鐘后上清轉(zhuǎn)至另新管中，加入等體積的異丙醇，混勻后立即在12000rmin條件下離心10分鐘。 (8) 沉淀用70乙醇清洗后，自然干燥，溶于40l水中加入8l 4 mol/l NaCl和32l 13PEG8000，混勻后，水上保溫1520分鐘。 (9) 在12000rmin條件下離心l0分鐘， 沉淀經(jīng)70乙醇清洗后，自然干燥，最后溶于40lTE緩沖液中。 植物基因與分子操作 顧紅雅 1995年04月第1版第二節(jié) DNA的純化及測定一、 氯化銫密度梯度離心法純化DNA本方法可以從各種方法得到的DNA粗提物中除去大部分的蛋白、RNA、多糖和其他雜質(zhì)。它對需要使用高純度DNA的實驗，如構(gòu)建DNA文庫十分有用。 氯化銫（分子生物學(xué)純） 溴化乙錠，5mg/mL 氯化銫飽和的異戊醇或異丙醇 3 mol/L 乙酸鈉 無水乙醇 70%乙醇 TE緩沖液: 10 mmol/L Tris-