LUMINEX技術(shù)原理及應(yīng)用

1、Luminex的基本原理及應(yīng)用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析主要采用雙抗體夾心ELISA法。此法長(zhǎng)期以來(lái)被視為蛋白質(zhì)定量分析的“標(biāo)準(zhǔn)方法”。ELISA可以用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定大批量生物樣品，但每次實(shí)驗(yàn)只能分析一個(gè)目標(biāo)分子，而不具備同時(shí)分析多種目標(biāo)分子的能力。在ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展出的 luminex技術(shù)，不僅同樣通過(guò)雙抗體選擇而具有高特異性，同時(shí)也具有ELISA的高通量、操作簡(jiǎn)便、測(cè)量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，而且可以在一次實(shí)驗(yàn)中完成對(duì)多種目標(biāo)分子的分析，從而改變了過(guò)去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平臺(tái)。Luminex技術(shù)原理，在近年發(fā)表的文章中已有過(guò)詳細(xì)的介紹和說(shuō)明。Luminex 技術(shù)應(yīng)用微球和流式細(xì)胞儀的原理。 微球

2、內(nèi)部含有三種熒光免疫熒光，通過(guò)熒光不同的比例可以區(qū)分500種不同的微球。每種微球可以用來(lái)檢測(cè)一種不同的蛋白或基因。 因此，利用微球技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)高達(dá)500個(gè)蛋白或基因。該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價(jià)交聯(lián)單克隆抗體，與被測(cè)定的目標(biāo)分子結(jié)合后，加入熒光素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，再通過(guò)激光掃描熒光編碼來(lái)識(shí)別單個(gè)微球和測(cè)量“檢測(cè)熒光”強(qiáng)度來(lái)確定被測(cè)分子的濃度。在使用相同抗體對(duì)的條件下，luminex技術(shù)的測(cè)量結(jié)果在準(zhǔn)確度、精確度、靈敏度方面與ELISA均可達(dá)到相似的水平。Luminex應(yīng)用的熒光編碼微球帶有針對(duì)不同目標(biāo)分子的特異性抗體，不同的微球在一定程度上可以自由組合，這樣在一次實(shí)驗(yàn)中可以同時(shí)完成多個(gè)目標(biāo)

3、分子的分析。多目標(biāo)分子的同時(shí)測(cè)定可以大大減少生物樣品的消耗量，節(jié)省成本和測(cè)定時(shí)間，并且使多種目標(biāo)分子之間相關(guān)性的分析更加準(zhǔn)確。很多公司已經(jīng)開(kāi)始提供Luminex試劑盒，用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究以及臨床檢測(cè)。目前，Luminex試劑盒已經(jīng)可以檢測(cè)500多種蛋白質(zhì)分子，包括細(xì)胞因子、激素、自身抗體、腫瘤標(biāo)志物等。Luminex常見(jiàn)問(wèn)題及解答LUMINEX應(yīng)用于哪些領(lǐng)域?生物醫(yī)學(xué)研究，生物標(biāo)記物開(kāi)發(fā)，臨床檢測(cè)等領(lǐng)域。Luminex技術(shù)主要用于蛋白和核酸檢測(cè)分析。LUMINEX敏感性如何？靈敏度取決于開(kāi)頭的質(zhì)量。對(duì)于同樣的抗體對(duì)，Luminex檢測(cè)的靈敏度高于ELISA技術(shù)。一般檢測(cè)靈敏度在pg級(jí)。對(duì)不

4、同類型的樣品制備和樣品量的要求是怎樣的？血清、血漿是常用的樣本，每次檢測(cè)需要10ul， 每次可以檢測(cè)多個(gè)蛋白。從各種細(xì)胞或組織中提取的蛋白也可以用Luminex技術(shù)檢測(cè)，制備方法與ELISA、Western Blot完全一樣。一般可以檢測(cè)到多少基因或蛋白的表達(dá)信息？檢測(cè)蛋白和基因的數(shù)目主要取決于試劑盒。 蛋白質(zhì)檢測(cè)目前最高可以達(dá)到50個(gè)左右，基因檢測(cè)最高達(dá)500個(gè)。如何保證檢測(cè)結(jié)果的特異性？檢測(cè)的特異性取決于抗體高特異性。 試劑幾乎全部來(lái)源于美國(guó)大公司，產(chǎn)品經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的質(zhì)量控制。同時(shí)，我們檢測(cè)公司也有近15年的經(jīng)驗(yàn)、嚴(yán)格的操作程序和質(zhì)量控制體系?？蛻糇约禾峁┛贵w，是否可以進(jìn)行LUMINEX檢測(cè)

5、？Luminex和ELISA檢測(cè)試劑都需要兩個(gè)配套的特異性抗體。我們公司具有開(kāi)發(fā)Luminex試劑盒的經(jīng)驗(yàn)。但是，需要一系列的開(kāi)發(fā)工作才能保證結(jié)果的特異性、重復(fù)性和可靠性。除了蛋白，LUMINEX技術(shù)是否還可以用于其它指標(biāo)的檢測(cè)？可以用于基因表達(dá)，基因多態(tài)性和HLA配型分析。檢測(cè)周期多久？視待測(cè)蛋白的種類、數(shù)量和標(biāo)本數(shù)量定。一般來(lái)說(shuō)，檢測(cè)一組蛋白（1-50個(gè)，視蛋白種類定）和一組標(biāo)本（多達(dá)360個(gè)標(biāo)）需要3-4小時(shí)的操作時(shí)間及基本數(shù)據(jù)分析。但是，檢測(cè)周期也取決于公司當(dāng)時(shí)的工作量。一般來(lái)說(shuō)，從標(biāo)本收到起，檢測(cè)應(yīng)在1-2周完成；但是部分蛋白試劑盒需要收到訂單后從美國(guó)進(jìn)口，檢測(cè)周期可能會(huì)延長(zhǎng)到4-5

6、周。如何判定 LUMINEX數(shù)據(jù)表達(dá)水平差異有無(wú)意義？表達(dá)差異主要取決于標(biāo)本的性質(zhì)和數(shù)量，我們公司為客戶提供專業(yè)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)服務(wù)。LUMINEX實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀的優(yōu)劣比較? Luminex技術(shù)是流式細(xì)胞儀和微球相結(jié)合的蛋白、核酸檢測(cè)技術(shù)， 檢測(cè)對(duì)象是蛋白質(zhì)、DNA等大分子。普通流式細(xì)胞儀主要用于檢測(cè)整體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)情況。Luminex檢測(cè)蛋白和標(biāo)本數(shù)目大，是一種高通量檢測(cè)技術(shù)。普通流式細(xì)胞儀每次只能檢測(cè)幾種蛋白分子，而且檢測(cè)速度較慢，不適合高通量分析。 由此可見(jiàn)，兩種方法應(yīng)用方向有很大差別。報(bào)告的格式如何？報(bào)告以xcel表格形式，包括每種蛋白在每個(gè)標(biāo)本中的表達(dá)量。公司也可以為客戶提

7、供數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。完成一個(gè)LUMINEX的實(shí)驗(yàn),需要的細(xì)胞的量是多少? 至少10ul的血清、血漿，蛋白提取物， 或50-100萬(wàn)細(xì)胞。如何控制LUMINEX檢測(cè)的質(zhì)量？我們對(duì)每一次檢測(cè)都設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)定內(nèi)參進(jìn)行校正。我們會(huì)定期做儀器校正，檢測(cè)精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)失敗有幾種原因? 從實(shí)驗(yàn)室角度看，成敗原因包括試劑盒的質(zhì)量，待測(cè)樣品稀釋倍數(shù)；待測(cè)蛋白質(zhì)低于儀器檢測(cè)底限，實(shí)驗(yàn)操作程序。從客戶角度看，成敗取決于樣品制備，保存和運(yùn)輸是否恰當(dāng)。我們公司可以提供規(guī)范操作程序，供客戶參考。得到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果后, 可以進(jìn)行那些研究的工作? 可進(jìn)行多方面的研究，例如：觀察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)

8、待測(cè)蛋白含量的影響，可進(jìn)行藥物作用靶點(diǎn)研究，不同人群血樣生物標(biāo)記物的研究，健康評(píng)估，疾病診斷，指導(dǎo)治療等。經(jīng)過(guò)分析后，若得到幾百個(gè)感興趣的基因或蛋白，如何對(duì)這些基因做功能分類或者Pathway相關(guān)分析呢？分析方法與其它技術(shù)平臺(tái)一樣，我們公司可以提供全套有償服務(wù)。如何考慮LUMINEX重復(fù)實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題？我們每次都會(huì)對(duì)使用的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參做重復(fù)性測(cè)定，同時(shí)也建議對(duì)每份樣本進(jìn)行重復(fù)2次測(cè)定。在進(jìn)行LUMINEX實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于經(jīng)費(fèi)的限制，是否可以把多個(gè)樣品進(jìn)行混合以消除樣品的個(gè)體差異后再上LUMINEX檢測(cè)？不建議這么做。多個(gè)樣品做檢測(cè)，計(jì)算平均值和誤差才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果多個(gè)樣品混合后測(cè)定只能算1份樣品。

9、客戶是組織的樣品，準(zhǔn)備自己提取樣品，請(qǐng)問(wèn)樣品提取方面有沒(méi)什么技術(shù)要求？需要采用對(duì)抗原抗體反應(yīng)，或者蛋白質(zhì)抗原性沒(méi)有抑制作用的提取液進(jìn)行提取，避免采用會(huì)造成蛋白質(zhì)變性的試劑，如高濃度的尿素或者鹽酸胍等。需要能完全提取待測(cè)蛋白質(zhì)，否則對(duì)結(jié)果會(huì)造成誤判。提取以后需要怎么保存，怎么運(yùn)輸？建議保存于-80度。避免反復(fù)凍融。可用干冰或者至少用冰袋運(yùn)輸。LUMINEX的假陽(yáng)性率是多少? 技術(shù)性的假陽(yáng)性率非常低，小于1%。生物假陽(yáng)性率取決于每個(gè)蛋白的生物學(xué)特征?？砷_(kāi)展此項(xiàng)目的臨床科室有哪些？目前我公司擁有的世界最先進(jìn)的高通量液相芯片檢測(cè)技術(shù)，在國(guó)內(nèi)僅有3臺(tái)。是否可以將同一癥狀的病例混合后抽提,看共性表達(dá)?可以

10、?；旌虾蟮臉悠穼⒈灰曌鲉我粯悠愤M(jìn)行檢測(cè)。服務(wù)流程如何？幫助客戶制定檢測(cè)方案樣品檢測(cè)結(jié)果分析報(bào)告出具可為客戶提供更深層次的服務(wù)（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫(xiě)與發(fā)表）如何訂購(gòu)您們的服務(wù)？通過(guò)咨詢，協(xié)商檢測(cè)方案，然后付費(fèi)或簽訂合同。 LUMINEX蛋白檢測(cè)平臺(tái)服務(wù)項(xiàng)目一、細(xì)胞因子、化學(xué)因子類：6Ckine/CCL2BCA-1/CXCL13CTACK/CCL27皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子EGF表皮生長(zhǎng)因子ENA-78/CXCL5 中性粒細(xì)胞激活蛋白-78Eotaxin 嗜酸細(xì)胞活化趨化因子Eotaxin-2/CCL24/MPIF-2嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-2Eotaxin-3/CCL26嗜酸細(xì)胞活化趨化因子

11、-3FGF-2 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2Flt-3 ligand FMS樣酪氨酸激酶3 配體Fractalkine 人神經(jīng)趨化因子GCP2/CXCL6 人中性粒細(xì)胞趨化蛋白2G-CSF 粒系集落刺激因子GM-CSF 粒-單系集落刺激因子GRO生長(zhǎng)相關(guān)基因蛋白HCC-1/3/CCL14/I-309/CCL1IFN2干擾素2IFN干擾素IL-10白介素-10IL-11白介素-11IL-12 (p40) 白介素-12IL-12 (p70) 白介素-12IL-13白介素-13IL-15白介素-15IL-16白介素-16IL-17白介素-17IL-1ra白介素-1raIL-1白介素1IL-1白介素-1IL

12、-2白介素-2IL-20 白介素-20IL-21 白介素-21IL-23 白介素-23IL-28a 白介素-28aIL-29 白介素-29IL-3白介素-3IL-33/NF-HEV (mature) 白介素-33IL-4 白介素-4IL-5 白介素-5IL-6 白介素-6IL-7 白介素-7IL-8 白介素-8IL-9 白介素-9IP-10 干擾素誘導(dǎo)蛋白-10I-TAC/CXCL11干擾素誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化因子LIF白血病抑制因子Lymphotactin淋巴細(xì)胞趨化蛋白MCP-1(MCAF)單核細(xì)胞趨化蛋白1MCP-2單核細(xì)胞趨化蛋白2MCP-3/CCL7單核細(xì)胞趨化蛋白3MCP-4單核細(xì)胞趨化

13、蛋白4M-CSF巨噬細(xì)胞集落刺激因子MDC/CCL22 巨噬細(xì)胞來(lái)源的趨化因子MIG/CXCL9趨化因子9MIP-1D (MIP-5/CCL15)巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1DMIP-1巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1MIP-1巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1MIP-3/CCL19巨噬細(xì)胞炎性蛋白3MIP-3/CCL20巨噬細(xì)胞炎性蛋白3MMP -1基質(zhì)金屬蛋白酶-1MMP -2 基質(zhì)金屬蛋白酶-2MMP -3 基質(zhì)金屬蛋白酶-3MMP -7 基質(zhì)金屬蛋白酶-7MMP -9 基質(zhì)金屬蛋白酶-9MMP -10 基質(zhì)金屬蛋白酶-10MMP -12 基質(zhì)金屬蛋白酶-12MMP -13 基質(zhì)金屬蛋白酶-13NAP-2/CXCL7中性

14、粒細(xì)胞趨化蛋白2PDGF-AA 血小板衍生生長(zhǎng)因子AAPDGF-AB/BB血小板衍生生長(zhǎng)因子AB/BBRANTES分泌趨化因子sCD30 可溶性CD30sCD40L可溶性CD40LSCF干細(xì)胞因子SDF-1+/CXCL12基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1+sEGFR可溶性表皮生長(zhǎng)因子受體sgp130 可溶性糖蛋白130sIL-1RI可溶性白細(xì)胞介素-1受體IsIL-1RII可溶性白細(xì)胞介素-1受體IIsIL-2R可溶性白細(xì)胞介素-2受體sIL-4R可溶性白細(xì)胞介素-4受體sIL-6R 可溶性白細(xì)胞介素-6受體sRAGE 可溶性晚期糖基化中產(chǎn)物受體sTNF RI 可溶性腫瘤壞死因子受體IsTNF RII可溶

15、性腫瘤壞死因子受體IIsVEGF R2 可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2sVEGF R3 可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3sVEGF RI 可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體ITARC/CCL17胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子TGF轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TIMP-1組織金屬蛋白酶抑制劑-1TIMP-2組織金屬蛋白酶抑制劑-2TIMP-3組織金屬蛋白酶抑制劑-3TIMP-4組織金屬蛋白酶抑制劑-4TNF 腫瘤壞死因子TNF腫瘤壞死因子TPO 甲狀腺過(guò)氧化物酶TRAIL/TNFSF10TSLP人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生產(chǎn)素VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子二、細(xì)胞信號(hào)通路類：Active Caspase 3 活化半胱胺酸蛋白酶 3Active Cl

16、eaved PARP活化切割的多腺苷二磷酸多聚酶Akt/PKB (Ser473) 磷酸化蛋白激酶BAkt/PKB (Thr308) 磷酸化蛋白激酶BATF2 (Thr69/71)活化復(fù)制因子2BAD (Ser112)CD3 (pan Tyr)c-Jun (Ser73)c-Kit (pan Tyr)Cleaved PARPc-Met/HGFR (pan Tyr)CREB (Ser133)EGF Receptor (pan Tyr)表皮生長(zhǎng)因子受體Erb-B2/HER2 (pan Tyr)第二人體表皮生長(zhǎng)因子受體ERK/MAP Kinase 1/2 (Thr185/Tyr187)GAPDHH2A.

17、X (Ser139)HSP27 (Ser 78)IGF1R (pan Tyr)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體IRS1 (pan Tyr)IB (Ser 32)JNK (Thr183/Tyr185)LAT (pan Tyr)Lck (pan Tyr)MEK1 (Ser222)MKK6 (Ser207/Thr211)MSK1 (Ser212)p21p38 (Thr180/Tyr182)p53 (Ser15)p53 (Ser46)p70 S6 Kinase (Thr412)PDGF Receptor (pan Tyr)Rsk1 (Ser380)STAT1 (Tyr701)STAT1 (Tyr707)STAT

18、2 (Tyr690)STAT3 (Ser727)STAT3 (Tyr705)STAT5A/B (Tyr694/699)STAT6 (Tyr641)Syk (pan Tyr)ZAP-70 (pan Tyr)三、神經(jīng)因子類：CortisolApo AlApo CIIIApo EBDNFCathepsin D組織蛋白酶DComplement C3Complement C4Complement Factor HC reactive protein (CRP) C-反應(yīng)蛋白MelatoninMIP-4MPONCAMNeurotensinOrexin AOxytocinPAI-1 (total)PDGF-

19、AAPDGF-AB/BBPEDFPrealbuminRANTESSAPsICAM-1Substance PsVCAM-11-Antitrypsin2-Macroglobulin-MSH-Endorphin四、骨代謝因子類：RANKLAdiponectin脂聯(lián)素IL-1ACTHIL-6InsulinLeptin瘦素Osteopontin (OPN)骨橋蛋白OsteocalcinOsteoprotegerinPTHTNF 腫瘤壞死因子五、皮膚生長(zhǎng)調(diào)控因子：CortisolFibronectinHSAInvolucrinLPSKeratin-6Keratin - 1Keratin - 10六、凋亡及

20、敗血癥因子：MIF巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子PAI-1 (Total)sFassFasLsICAM-1sVCAM-1七、免疫球蛋白分型：IgAIgG1IgG2IgG3IgG4IgM八、腫瘤生物標(biāo)記物：CA-125癌抗原125IGF-II 胰島素樣生長(zhǎng)因子2Leptin瘦素MIF巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子Osteopontin (OPN)骨橋蛋白Prolactin泌乳刺激素MMP-1基質(zhì)金屬蛋白酶-1MMP-2 基質(zhì)金屬蛋白酶-2MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶-9CA 15-3癌抗原檢測(cè)15-3Serum amyloid A血清淀粉樣蛋白ACA 19-9癌抗原19-9TGF 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Cathepsin D組織

21、蛋白酶DTNF 腫瘤壞死因子VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGFR2血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2-2-Microglobulin -2微球蛋白CEA 癌胚抗原C reactive protein (CRP) C-反應(yīng)蛋白E-cadherin 上皮型鈣黏附蛋白EGFR表皮生長(zhǎng)因子受體Eotaxin 嗜酸細(xì)胞活化趨化因子ER- 雌激素受體Fas(CD95 or Apo-1) 腫瘤壞死因子受體超家族成員6Ferritin 鐵蛋白Fibrinogen纖維蛋白原AFP 甲胎蛋白Follistatin 卵泡素G-CSF 集落刺激因子3Haptoglobin 結(jié)合珠蛋白HER-2(erbB2) 第二人體表皮生長(zhǎng)因子受

22、體ICAM-1細(xì)胞間粘附分子-1IGFBP-1胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3Angiopoietin-2血管生成素2LH賴氨酸羥化酶MCP-1(MCAF)單核細(xì)胞趨化蛋白1MIG/CXCL9趨化因子9tPSA總前列腺特異性抗原fPSA游離前列腺特異性抗原NSE神經(jīng)元特異性烯醇化酶Free-hCG游離血清人絨毛膜促性腺激素EB antibody EB病毒抗體HE4人附睪分泌蛋白4CA215癌抗原215CA242癌抗原242CA724癌抗原724CA50癌抗原50Cyfra 21-1角蛋白19片段SCCA鱗狀細(xì)胞癌抗原九、內(nèi)分泌激素類：ACTHAGRPAmylin (Active or Total)BDNFCNTFC-PeptideFSHGHGLP-1 (Active)GlucagonIGF-1IGFBP-1胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1IGFBP-2胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2IGFBP-3胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3IGFBP-4胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白4IGFBP-5胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5IGFBP-6IGFBP-7InsulinLeptinLH賴氨酸羥化酶Prolactin泌乳刺激素TSHGhrelin (Active)GIP (Tota