CD19CART細(xì)胞制備工藝

1、CD19-CAR-T細(xì)胞制備工藝規(guī)程1 目的：制備符合規(guī)定、合格的CD19-CAR-T細(xì)胞2 范圍：3 職責(zé)：3.1 技術(shù)人：負(fù)責(zé)按本工藝規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞制備3.2 實(shí)驗(yàn)室主管：負(fù)責(zé)本工藝規(guī)程的執(zhí)行。3.3 質(zhì)量部：負(fù)責(zé)細(xì)胞制備全過程的監(jiān)督和管理。4 內(nèi)容：4.1 產(chǎn)品名稱、劑型、規(guī)格：l 產(chǎn)品名稱： CD19-CAR-Tl 產(chǎn)品劑型： l 規(guī)格：100mLl 性狀： 液體l 存儲(chǔ)條件及效期： l 內(nèi)包裝： 4.2 產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：詳見XXX細(xì)胞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)4.3 儀器、設(shè)備一覽表：序號(hào)儀器設(shè)備性能要求序號(hào)儀器設(shè)備性能要求1潔凈工作臺(tái)/生物安全柜A級(jí)8條碼打印機(jī)2二氧化碳培養(yǎng)箱9醫(yī)用40C冰箱3普通離

2、心機(jī)10超低溫冰箱4掌上離心機(jī)11熱合機(jī)5倒置顯微鏡12水浴鍋6可調(diào)式移液器（移液槍）13細(xì)胞計(jì)數(shù)儀7電動(dòng)輔助移液器144.4 試劑一覽表：序號(hào)試劑名稱規(guī)格1細(xì)胞培養(yǎng)基1L/瓶2細(xì)胞因子A1ug/uL3細(xì)胞因子B106 IU/mL4淋巴細(xì)胞分離液500mL/瓶6轉(zhuǎn)染增效劑8ug/mL7生理鹽水500mL/瓶8CD19-CAR-T慢病毒上清10mL/支4.5 耗材一覽表：序號(hào)耗材規(guī)格1細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板6孔板2細(xì)胞培養(yǎng)瓶T25T75T1753培養(yǎng)袋2L/個(gè)4離心管15mL50mL250mL5移液管5mL10mL25mL6細(xì)胞濾網(wǎng)100目/個(gè)7輸液袋100mL8巴氏吸管3mL/5mL9EP管1.5

3、mL4.6 試劑的配制：4.6.1 培養(yǎng)基：將1支106 IU的細(xì)胞因子B溶于1L培養(yǎng)基，配成完全培養(yǎng)基1。取40mL完全培養(yǎng)基1，加入2uL細(xì)胞因子A，配成完全培養(yǎng)基2。4.7 細(xì)胞制備工序要求：工序操作間潔凈級(jí)別設(shè)備名稱潔凈級(jí)別細(xì)胞制備制備室C級(jí)潔凈工作臺(tái)/生物安全柜A級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)室C級(jí)CO2培養(yǎng)箱C級(jí)細(xì)胞收集制備室C級(jí)潔凈工作臺(tái)/生物安全柜A級(jí)4.8 細(xì)胞制備流程圖4.9 細(xì)胞制備：4.9.1 第0天：第0天外周血交接1、 技術(shù)員檢查：Ø 存放血液的容器是否完好并密封；Ø 標(biāo)識(shí)是否清晰完整并正確；Ø 血液是否結(jié)塊，是否有溶血；Ø 血液量是否與標(biāo)識(shí)

4、一致。2、 檢查確認(rèn)合格后，填寫標(biāo)本采集交接記錄，雙人簽名確認(rèn)。3、 接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制備區(qū)。制備前準(zhǔn)備1、 淋巴細(xì)胞分離液和培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫。2、 準(zhǔn)備好若干50mL離心管和24孔培養(yǎng)板。單個(gè)核細(xì)胞的分離提取1. 取出500uL全血置于一干凈的1.5mL EP管中，用于血液三分類和流式檢測。2. 將外周血用生理鹽水按1:1體積比稀釋。3. 加入15mL淋巴細(xì)胞分離液至50mL離心管管底，用25mL移液管將35mL血細(xì)胞小心緩慢鋪在淋巴細(xì)胞分離液上（電動(dòng)移液器吹液速度為零）。4. 1800rpm,20 min 常溫離心，離心機(jī)升6降3。5. 小心移去生理鹽水層，吸取

5、白膜層至50mL離心管，補(bǔ)加生理鹽水至離心管滿體積,500g，5min 常溫離心。6. 倒去上清，加入生理鹽水,重懸細(xì)胞，常溫離心。洗2-3遍。7. 用完全培養(yǎng)基2重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。T細(xì)胞重懸和誘導(dǎo)活化1、 按3×106個(gè)細(xì)胞/mL/well鋪在24孔板上。2、 將24孔置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37，5%二氧化碳）培養(yǎng)。清場1、 將被血液污染的耗材棄置在生物安全垃圾袋中。2、 完全培養(yǎng)基1和2配制完后4度保存。注意事項(xiàng)1、4.9.2 第1天（細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)）：第1天帶CD19-CAR慢病毒上清轉(zhuǎn)染T細(xì)胞1、將24孔板的細(xì)胞收集，用生理鹽水洗滌兩次，500g,5min常溫離心。2、用帶C

6、D19-CAR慢病毒上清重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并用病毒上清稀釋至終濃度3×106個(gè)細(xì)胞/mL，加入總體積千分之一體積的轉(zhuǎn)染增效劑。3、1000g，離心，2h。 4、在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)8小時(shí)后每個(gè)24孔板的孔補(bǔ)加500uL完全培養(yǎng)基1。注意事項(xiàng)1、4.9.3 第3天（轉(zhuǎn)瓶、補(bǔ)液）第3天轉(zhuǎn)瓶、補(bǔ)液1、將24孔板的細(xì)胞轉(zhuǎn)入T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并補(bǔ)充等倍體積的完全培養(yǎng)基1進(jìn)T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。注意事項(xiàng)1、4.9.4 第5天（轉(zhuǎn)袋、補(bǔ)液）：第5天CD19-CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)袋補(bǔ)液1、 補(bǔ)充完全培養(yǎng)基1至400mL后，轉(zhuǎn)入2L的培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項(xiàng)1、 轉(zhuǎn)袋后間隔1天攤開手掌輕壓一下培養(yǎng)袋，以推散細(xì)胞聚集。注意事項(xiàng)操作完，及時(shí)清場，并做好相關(guān)記錄以及細(xì)胞制備檔案填寫。清場1、4.9.5 第10天（收獲細(xì)胞）第10天收獲細(xì)胞1、將2L培養(yǎng)袋的細(xì)胞培養(yǎng)液分裝至225mL的離心管中，500g,5min。2、將細(xì)胞用生理鹽水洗兩次，并用100mL生理鹽水重懸。3、將細(xì)胞懸液過細(xì)胞濾網(wǎng)后，進(jìn)袋，密封。注意事項(xiàng)1、細(xì)胞進(jìn)袋前注意收集上清液留作質(zhì)檢用。2、留取少