蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化其他方法

1、蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化其他方法自然界在長期的進(jìn)化過程中.產(chǎn)生了許多具有重要功能的符合人們需要 的理想蛋白質(zhì)，然而，當(dāng)它們處于復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)體系時(shí)，貝y往往不能滿足 人們的需要。為此，必須不斷推出新的方法來改造現(xiàn)有的蛋白質(zhì)，以滿足工 業(yè)的需要。自然進(jìn)化是有機(jī)體在長期的進(jìn)化過程中自發(fā)出現(xiàn)的非常緩慢的過 程。自然選擇往往是朝著有利于機(jī)體的方向進(jìn)行的。大量定點(diǎn)基因突變實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)功能和性質(zhì)的改變來自于許多小的內(nèi)部修飾的積累，這些小的 修飾或突變分布于較大的序列空間內(nèi)，人們?cè)噲D利用已有的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)(rati onal design),但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性極大地增 加了合理設(shè)計(jì)的難

2、度，更何況，對(duì)于大多數(shù)要改造的蛋白質(zhì)來說，我們并不 清楚其三維結(jié)構(gòu)信息，不能進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，而近年來發(fā)展的分子定向進(jìn)化(molecular directed evolution)策略屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)范疇，它不需 要事先了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制，而是在體外模擬自然進(jìn)化的過程(隨機(jī)突變、重組和選擇)，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需 性質(zhì)或功能，從而在幾天或幾周內(nèi)實(shí)現(xiàn)自然界需數(shù)百萬年才能完成的事情。定向進(jìn)化第一步是由一個(gè)靶基因或一群相關(guān)的家族基因起始創(chuàng)建分子 多樣性(突變和/或重組)；然后對(duì)該多樣性文庫的基因產(chǎn)物進(jìn)行篩選，那 些編碼改進(jìn)功能產(chǎn)物的基因被利用來繼續(xù)下一輪進(jìn)化；重復(fù)這

3、個(gè)過程直到達(dá) 到目標(biāo)。該進(jìn)化策略有以下三個(gè)顯著特征：a.進(jìn)化的每一關(guān)鍵步驟都受到嚴(yán)密控制；b.除修飾改善蛋白質(zhì)已有特性和功能外，還可引入一個(gè)全新的功能，來執(zhí)行從不被生物體所要求的反應(yīng)；甚至為生物體策劃一個(gè)新的代謝途徑； c.能從進(jìn)化結(jié)果中探索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本特征。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化通常分三步進(jìn)行：基因隨機(jī)誘變、體外重組和篩選。每 一步都可以有多種方法。常見的定向進(jìn)化方法有：易錯(cuò)PCR技術(shù)DNA改組技術(shù)外顯子改組 交錯(cuò)延伸重組隨機(jī)引物體外重組法(RPR)。當(dāng)然還有其他的方法，下 面就來給大家一一介紹。一、隨機(jī)誘變化學(xué)誘變劑介導(dǎo)的隨機(jī)誘變體外隨機(jī)誘變也可在65C下直接用羥胺處理帶有目的基因片段的

4、質(zhì)粒， 然后用限制性內(nèi)切酶切下突變了的基因片段，再克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行功能的篩選。由致突變菌株(mutator strain)產(chǎn)生隨機(jī)突變美國stratagene公司構(gòu)建了一株DNAI復(fù)途徑缺陷的大腸桿菌突變株 XLI-Red，它體內(nèi)的DN庚變率比野生型高五千倍。將帶有要突變基因的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到XLl-Red菌株內(nèi)復(fù)制過夜，在此過程中會(huì)產(chǎn)生隨機(jī)突變。每兩千個(gè)堿 基中通常約有一個(gè)堿基置換。將帶有突變過的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)系統(tǒng)中 進(jìn)行篩選。連續(xù)幾代的隨機(jī)突變和篩選的方法是從每一代中挑選出一個(gè)最佳的突 變體作為下一代的親本。通過積累氨基酸的正突變，可加快進(jìn)化的進(jìn)程。定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和突變技術(shù)定點(diǎn)突變

5、技術(shù)(Site directed mutagenesis)般用于對(duì)DN分子特定位點(diǎn)的突變，所以需要預(yù)先知道野生型基因序列。 早在1978年Michael Smith 就運(yùn)用寡核苷酸進(jìn)行定點(diǎn)突變。定點(diǎn)突變的基本原理是首先合成一段含有突 變堿基的DNAI物，然后這段合成的引物可以雜交到包含有目的基因的單鏈DN上，用DNA聚合酶將剩余片段進(jìn)行延伸，得到的雙鏈分子轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞 并被克隆，最后用特定的篩選方法將突變子篩選出來。定點(diǎn)突變技術(shù)有盒式 誘變和多種基于PCR勺突變方法，最常見的有重疊PC等方法。當(dāng)靶位點(diǎn)氨基 酸分別可被其它19種氨基酸代替而得到突變子的方法，稱為定點(diǎn)飽和突變技 術(shù)，此方法是要著

6、重尋求靶位點(diǎn)的最適氨基酸。定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和突變技 術(shù)的運(yùn)用，能極大地豐富突變體庫的多樣性。組合活性中心飽和突變?cè)囼?yàn)組合活性中心飽和試驗(yàn)(combinatorial active .site saturation test ,CAST的基本原理是：在酶的活性中心部位尋找一系列在空間位置上相互接 近的氨基酸對(duì)作為突變位點(diǎn)，選擇的氨基酸對(duì)必須是在側(cè)鏈基團(tuán)取向上具有 潛在的協(xié)同作用。因此，突變后才可能獲得更具有潛力的突變體。這是單點(diǎn) 突變不能做到的。如果選擇的氨基酸對(duì)應(yīng)的位置是 n,貝卩第2個(gè)氨基酸的選擇 遵循以下的原則：如果第n個(gè)氨基酸在環(huán)上，則另一個(gè)氨基酸選擇第 n+1位； 若在B折疊上則選擇第

7、n+2位，若在310螺旋上，則選擇第n+3位；若在a螺旋 上，則選擇第n+4位。對(duì)于CAS突變體庫容量的計(jì)算：每突變一對(duì)氨基酸要 進(jìn)行飽和隨機(jī)突變，即這一對(duì)氨基酸要突變成 20種氨基酸的任何一種。以2NNK(代表任何一種核苷酸，K代表是G或 T)作為突變的堿基形式，則有32=1 024種不同的組合，而氨基酸則可突變成 202=400種不同的組合。因此，要將 每個(gè)庫的所有突變的覆蓋率達(dá)到95%，則每個(gè)庫至少要挑3000個(gè)克隆子。此外，近年來還發(fā)展出了更多的、新穎的無性突變技術(shù)。例如，三核苷 酸突變(TriNex)，隨機(jī)插入-刪除突變(RID)，序列飽和突變(SeSaM)以及它 的改進(jìn)方法SeSa

8、Tv+。這些方法都是為了能最大程度的增強(qiáng)突變體庫的多 樣性，豐富并延伸無性突變的方法手段。二、基因體外重組限制性酶切-再連接介導(dǎo)的基因重組(recombining the genes by restrictio n and religatio n)利用限制性內(nèi)切酶對(duì)欲重組的兩個(gè)以上 DN序列進(jìn)行酶切，然后在連接 酶的作用下隨機(jī)重新連接起來，可實(shí)現(xiàn) DN分子問的重組。實(shí)驗(yàn)證明，簡單 的酶切-再連接可進(jìn)一步提高對(duì)硝基苯酯酶的活性。但如果兩個(gè)正突變處于 同一段限制性酶切片段上，貝S無法將它們重組于同一序列中?；蚣易甯慕M在基因改組的基礎(chǔ)上，1998年由Crameri等提出了基因家族改組技術(shù) (DNA

9、 family shuffli ng)，至此才是真正的有性重組的開始?；蚣易甯慕M 與單基因改組最大的區(qū)別在于出發(fā)序列的同源性。利用基因家族同源序列進(jìn) 行DNA改組，實(shí)現(xiàn)同源重組。由于同源序列是經(jīng)過自然選擇保留下來的相對(duì) 有益或無害的片段，所以基因家族改組的突變機(jī)率和改組效率明顯提高，體 現(xiàn)了基因的多樣性。過渡模板隨機(jī)嵌合生長過渡模板隨機(jī)嵌合生長(random chimeragenesis on transient templatesRACHITT )技術(shù)是與DNA shuffling概念上明顯不同的、改進(jìn)的基因家族重 組技術(shù)。它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯(cuò)延伸反應(yīng)，而是將隨機(jī)切割的基因 片段雜

10、交到一個(gè)臨時(shí)DNA模板上進(jìn)行排序、修剪、空隙填補(bǔ)和連接(圖2) 其中的懸垂切割步驟使短片段(比 DNase消化片段還短)得以重組，明顯提 高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯(cuò)誤傾向PCR還可引入額外點(diǎn)突變。CoCo等首次報(bào)道此法改造二苯并噻吩單加氧酶，產(chǎn)生的嵌合文庫平均 每個(gè)基因含14個(gè)交叉，重組水平比DNA shuffling類方法(14個(gè)交叉)高出幾倍；并且可在短至5bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉。這種高頻率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所難以達(dá)到的。會(huì)尿略摩的另一親本基禺的 尸桂低為釉時(shí)耳丁礙橫脈I娶剪曇垂呼列、單補(bǔ)空、連接J統(tǒng)劇.模梅睜列引人F代厳和體碎去昨架輕板齪制51

11、橇菟履和歸粧Fig. 2 Tht general procedure of RACHTn9-1圖2 RACHITTS基本程序®酵母增強(qiáng)組合文庫酵母增強(qiáng)組合文庫(comb in atorial libraries enhan ced byrecomb in ati on in yeast, CLER Y)是一個(gè)真核基因家族 shuffli ng 策略。其 原理是將體外DNA shuffling程序與接下來的酵母體內(nèi)重組締合起來，構(gòu)建高 豐度低親本水平的重組文庫：直接以含目的基因的質(zhì)粒作為體外shuffli ng的模板；shuffling后基因產(chǎn)物與線性化的酵母表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞啟動(dòng)

12、體 內(nèi)重組事件，同時(shí)表達(dá)功能性重組子直接用于篩選。Trua n等用該法重組人細(xì)胞色素P450 1A1和1A2，所得文庫含86%的嵌合基因，大大提高了文庫豐 度；另外，用單鏈DNA做shuffling的模板可進(jìn)一步降低文庫中的親本比率。 該法為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能研究、多組分真核復(fù)合酶活力的調(diào)控提供了一個(gè)新 的有力工具。漸增切割法產(chǎn)生雜和酶盡管DNA shuffling介導(dǎo)的重組已成為定向進(jìn)化創(chuàng)建高質(zhì)量序列多樣性 的重要工具，但它們通常不能用于重組同源性低于70%80%的序列。而自然 界大多數(shù)同源序列具有比這個(gè)數(shù)目低得多的相似性。為了解決這個(gè)問題，Ben kovic研究組建立了漸增切割法產(chǎn)生雜和酶（

13、in creme ntal trun cation for the creation of hybrid enzymes ITCHY ）及Thio-ITCHY （ a -硫代磷酸核苷酸介 導(dǎo)的ITCHY ）方法來產(chǎn)生不依賴于DNA序列同源性的重組文庫。ITCHY的基 本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10堿基/ min ,然后間隔很短 時(shí)間連續(xù)取樣終止反應(yīng)，以獲得一組依次有一個(gè)堿基缺失的片段庫；然后將 基因A的一組隨機(jī)長度的5端片段與基因B的一組隨機(jī)長度的3端片段隨機(jī) 融合產(chǎn)生雜合基因文庫。但由于該方案冗長繁瑣，Lutz等又提出了Thio-ITCHY方法：首先將待PCf反應(yīng)或單鏈模板引

14、伸反應(yīng)將a -硫代磷酸核苷 酸隨機(jī)引入產(chǎn)物中，由于其抗核酸外切酶皿的切割，接下來的切割反應(yīng)會(huì)在 此處隨機(jī)終止，連接切割產(chǎn)物即產(chǎn)生隨機(jī)交叉文庫該法操作便利，同時(shí)也可 引入隨機(jī)點(diǎn)突變。此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依賴DNA序列同源性，可在 非序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生活性融合子。迭代ITCHY或?qū)ζ湮膸爝M(jìn)行shuffling還可 以創(chuàng)造多個(gè)交叉。不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組盡管上述ITCHY可以進(jìn)行不依賴于序列同源性的重組，但它是一個(gè)隨機(jī)長度片段與另一個(gè)隨機(jī)長度片段相融合，結(jié)果文庫中基因長度不再保守，子 代中功能雜合子的比率很低。要想提高功能雜合子所占比例，須使交叉發(fā)生 在具有相似結(jié)構(gòu)環(huán)境的位置

15、，但由于缺乏足夠的序列相似性，同源重組不能 發(fā)揮作用，因此Sieber等提出了不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組（sequeneehomology-i ndepe ndent protein recomb in ati on, SHIPREC )方法：通過瓊脂 糖凝膠電泳回收單基因長度隨機(jī)片段，保證了子代嵌合體長度的保守性，使 交叉保持了適當(dāng)?shù)男蛄衅ヅ?，主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的位點(diǎn)，交叉點(diǎn)處的兩 個(gè)氨基酸仍處于它們?cè)谟H本蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的位置，從而提高了文庫中陽性克隆的比例。該法可以在低序列同一性甚至無序列同一性的同源蛋白質(zhì)間創(chuàng)造 具有單交叉的雜合蛋白質(zhì)組合文庫。迭代 SHIPREC可以產(chǎn)生多個(gè)交叉。隨著

16、酶分子定向進(jìn)化的發(fā)展，在常規(guī)的定向進(jìn)化方法的基礎(chǔ)上，又相繼 開發(fā)出另一些新方法，如設(shè)計(jì)的寡核苷酸裝配 (assembly of desig ned olig onu cleotides , ADO)誘變和單向重組 (mutage nic and uni directi onal reassembly，MURA)隨機(jī)插入-刪除鏈交換突變(random insertional deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于 Y連接的構(gòu)件改組(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)合成改組(syntheticsh

17、uffli ng)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也為更好的進(jìn)行定向進(jìn)化提供了強(qiáng)有力的工具和指導(dǎo)思想。三、文庫篩選策略一旦多樣性文庫構(gòu)建好后，定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)成敗與否的關(guān)鍵則在于“要有 針對(duì)目的改造特征的高效篩選方案”。近幾年，與創(chuàng)建多樣性重組文庫的發(fā) 展相適應(yīng)，在高流通量和超高流通量篩選技術(shù)方面也取得另人矚目的成就。 其中核糖體展示技術(shù)與mRNA展示技術(shù)，由于在體外無細(xì)胞翻譯體系中進(jìn) 行，不受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的限制，大大提高了文庫容量和篩選通量(10121014)。 它們的原理是通過篩選靶蛋白-核糖體-mRNA三元復(fù)合物或靶蛋白-mRNA二 元復(fù)合物，將基因型與表型直接偶聯(lián)起來，并利用mRNA的可復(fù)

18、制性，使靶基因(蛋白)得到有效富集。利用此法進(jìn)化單鏈抗體可變區(qū)scFv片段，獲得親和力提高40倍的變異株其他高通量篩選方法，如細(xì)胞表面展示技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)；將 靶活力與轉(zhuǎn)錄信號(hào)相偶聯(lián)的三雜交體系；以發(fā)光信號(hào)為指示的反射增進(jìn)系 統(tǒng)；利用熒光信號(hào)的熒光共振能量轉(zhuǎn)換儀（FRET，結(jié)合熒光激活細(xì)胞篩選 儀（FACS），每小時(shí)可篩選60000個(gè)細(xì)胞。最近Chadessy等還報(bào)道了一種隔 室化自復(fù)制技術(shù)，通過一個(gè)只復(fù)制其自身基因的聚合酶組成的簡單反饋環(huán)將 體外進(jìn)化與篩選有機(jī)結(jié)合起來，使陽性克隆得到快速、高效的富集，獲得熱 穩(wěn)定性提高11倍，肝素抗性提高130多倍的Taq DNA聚合酶突變株。在硬件

19、設(shè)備方面，1536和3456孔板以及多通道多波長檢測儀的出現(xiàn)、 每秒鐘分配幾千滴皮升級(jí)樣品的非接觸式壓電配樣儀的問世等都大大提高 了樣品處理速度。定向進(jìn)化的意義定向進(jìn)化不僅在工業(yè)、醫(yī)療方面對(duì)蛋白質(zhì)的改造具有重要的意義，而 且，它也非常適合于基礎(chǔ)理論的研究。對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)化得到的突變體進(jìn)行 分析，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系提供了新的工具。天然蛋白質(zhì)序列 中往往有很多是隨機(jī)遺傳漂移，而不是功能性的適應(yīng)。例如，從適應(yīng)不同環(huán) 境的物種中提取出的蛋白質(zhì)經(jīng)常有幾十個(gè)氨基酸的不同，其中只有一小部分是與特定功能差異有關(guān)的。大量的中性突變只能干擾科學(xué)家辨別分子的規(guī) 律。在實(shí)驗(yàn)室的進(jìn)化實(shí)驗(yàn)中，種系很清楚，而且

20、突變主要是適應(yīng)性的。Amold 等人使用高保真DN改組成功地區(qū)分出基因中的功能性和非功能性突變。通 過定向進(jìn)化來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，可為蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)1. Zhao Huimin;Arnold Frances H查看詳情外文期刊19972. Zhao Huimin;Arnold Frances H查看詳情外文期刊1997(94)3. Gree ner A;Callaha n. M Perform Ran dom Mutage nesis 19944.Seiichi Taguchi;Akiyoshi Ozaki;Haruo Momose查看詳情外文期刊1998(

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