有機(jī)小分子熒光探針的研究1

1、什么是熒光探針？ 熒光探針是建立在光譜化學(xué)和光學(xué)波導(dǎo)與測(cè)量技術(shù)基礎(chǔ)上，選擇性的將分析對(duì)象的化學(xué)信息連續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測(cè)量的熒光信號(hào)的分子測(cè)量裝置。 熒光探針受到周圍環(huán)境的影響，使其發(fā)生熒光發(fā)射發(fā)生變化，從而使人們獲知周圍環(huán)境的特征或者環(huán)境中存在的某種特定信息熒光分子探針的優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高 選擇性好 使用方便 成本低 不需預(yù)處理 不受外界電磁場(chǎng)影響 遠(yuǎn)距離發(fā)光熒光分子探針的結(jié)構(gòu) 熒光分子探針通常由三部分組成： 識(shí)別基團(tuán)（receptor） 熒光基團(tuán)（fluorophore） 連接體部分（spacer） FSRhvstrongly fluorescentFluorephoreSpacerRecep

2、torAnalyte識(shí)別基團(tuán)決定了探針分子的選擇性和特異性，報(bào)告基團(tuán)則決定了識(shí)別的靈敏度，而連接體部分則可起到分子識(shí)別樞紐的作用。熒光分子探針的設(shè)計(jì)原理 熒光分子探針的設(shè)計(jì)原理主要有以下幾種：鍵合-信號(hào)輸出法、置換法和化學(xué)計(jì)量計(jì)法。1、鍵合-信號(hào)輸出法 熒光 連接體 識(shí)別 被分析物 信號(hào)輸出 基團(tuán) 基團(tuán)鍵合-信號(hào)輸出法是指將探針中的識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)通過共價(jià)鍵連接起來(lái)設(shè)計(jì)熒光探針的方法。 當(dāng)識(shí)別基團(tuán)與被分析物結(jié)合時(shí)會(huì)引起熒光基團(tuán)的化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，通過顏色的改變、光譜的移動(dòng)、熒光強(qiáng)度的增減等現(xiàn)象來(lái)表現(xiàn)，這些變化可被裸眼或者儀器識(shí)別。這是目前為止在設(shè)計(jì)熒光探針中應(yīng)用最廣泛的方法 。 作為熒光基團(tuán)

3、的香豆素和作為識(shí)別基團(tuán)的鄰氨基苯硫醚以席夫堿相連，加入鋅離子后，與硫醚上的硫原子、席夫堿上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到結(jié)構(gòu)2，抑制了席夫堿上C=N鍵的旋轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)了熒光從無(wú)到有的變化 12基于鍵合-信號(hào)輸出法設(shè)計(jì)的鋅離子熒光探針 2、置換法識(shí)別基團(tuán) 被分析物 識(shí)別基團(tuán) 熒光基團(tuán) 結(jié)合熒光基團(tuán) 結(jié)合被分析物 基于置換法設(shè)計(jì)的熒光探針 該原理是利用識(shí)別基團(tuán)分別與熒光基團(tuán)和被分析物結(jié)合能力的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)被分析物的檢測(cè)。 識(shí)別基團(tuán)和熒光基團(tuán)形成絡(luò)合物，當(dāng)被分析物加入到該體系中時(shí)，由于識(shí)別基團(tuán)與被分析物的結(jié)合能力要強(qiáng)于識(shí)別基團(tuán)與熒光基團(tuán)的結(jié)合能力，因此被測(cè)物將熒光基團(tuán)置換出來(lái)，從而引起了整個(gè)體系熒光

4、等化學(xué)參數(shù)的變化，進(jìn)而為儀器或者裸眼識(shí)別，該原理常用于設(shè)計(jì)陰離子熒光探針。 CN-Cu(CN)234Cu2+ 化合物3以氟硼熒為熒光團(tuán)修飾了DPA為識(shí)別基團(tuán)，探針本身熒光很強(qiáng)，但與銅離子絡(luò)合后可形成結(jié)構(gòu)3，從而淬滅了氟硼熒的熒光，加入氰根離子后，由于銅離子與氰根離子的結(jié)合常數(shù)更大，從而把作為熒光基團(tuán)的氟硼熒衍生物從絡(luò)合狀態(tài)中置換出來(lái)得到結(jié)構(gòu)4，使之進(jìn)入溶液，熒光恢復(fù)，而其它的陰離子沒有這樣的現(xiàn)象，因此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)氰根離子的檢測(cè)。 3、化學(xué)計(jì)量計(jì)法 探針分子 被分析物 新物質(zhì)A 探針分子 被分析物 中間體 新物質(zhì)B 新物質(zhì)C 基于化學(xué)計(jì)量計(jì)設(shè)計(jì)的熒光探針（I）被分析物和探針分子反應(yīng)形成了共價(jià)化合物

5、； （II）被分析物催化探針分子反應(yīng)生成兩種新物質(zhì) 化學(xué)計(jì)量計(jì)法是利用探針分子和被分析物之間發(fā)生的特定化學(xué)反應(yīng)（一般是不可逆反應(yīng)）來(lái)改變探針?biāo)幍幕瘜W(xué)環(huán)境，從而對(duì)被分析物進(jìn)行識(shí)別的一種方法。根據(jù)化學(xué)計(jì)量計(jì)法設(shè)計(jì)的探針可以稱為化學(xué)計(jì)量計(jì)，主要包括兩種類型： 一、探針分子和被分析物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后形成共價(jià)化合物（I）； 二、被分析物催化探針分子反應(yīng)生成兩種新物質(zhì)（II）。 一般而言，基于化學(xué)計(jì)量計(jì)原理設(shè)計(jì)的熒光分子探針通常具有不可逆性和較好的選擇性。 基于化學(xué)計(jì)量計(jì)法設(shè)計(jì)的次氯酸根離子熒光探針 根據(jù)次氯酸根可以氧化羥胺的特性，設(shè)計(jì)合成了化合物5，當(dāng)次氯酸根存在時(shí)可氧化羥胺結(jié)構(gòu)，使羅丹明開環(huán)，從而形成

6、結(jié)構(gòu)6，最終進(jìn)一步水解為羅丹明6G本身7，而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。而其它氧化性分子沒有這樣的特性，因此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)水相中次氯酸根的高選擇性檢測(cè)。 熒光探針的響應(yīng)機(jī)理熒光分子探針主要有如下幾種響應(yīng)機(jī)理：1、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET, photo-induced electron transfer）2、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT, intramolecular charge transfer）3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET, fluorescence resonance energy transfer）4、激基締合物（excimer/exciplex）1 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET, photo-induced e

7、lectron transfer） 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的過程。 識(shí)別基團(tuán)與被分析物結(jié)合之前，熒光基團(tuán)受激發(fā)，最終被光激發(fā)到激發(fā)態(tài)的電子不能躍遷到基態(tài)，使得熒光基團(tuán)的熒光淬滅。而識(shí)別基團(tuán)與被分析物結(jié)合后，PET過程受阻，熒光基團(tuán)的熒光得以恢復(fù)。 PET過程可以用前線軌道理論具體解釋：當(dāng)識(shí)別基團(tuán)不存在時(shí)，熒光團(tuán)被光激發(fā)后，其最高占據(jù)軌道（HOMO）的一個(gè)電子躍遷到最低空軌道（LUMO）,能夠產(chǎn)生熒光； 若外來(lái)識(shí)別基團(tuán)的HOMO或LOMO軌道介于熒光團(tuán)兩軌道能量之間，此時(shí)就可以發(fā)生識(shí)別基團(tuán)與熒光團(tuán)之間的電子轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致熒光的猝滅。

8、即PET過程阻止了熒光團(tuán)的一個(gè)電子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的非輻射躍遷途徑，降低了熒光團(tuán)的量子產(chǎn)率，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的減弱或淬滅。 PET識(shí)別分析物理論示意圖 PET1 識(shí)別基團(tuán)對(duì)熒光團(tuán)的PET過程發(fā)生和受阻的前線軌道理論解釋 第一種是識(shí)別基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移（PET1），如圖1.9所示，即識(shí)別基團(tuán)的HOMO軌道介于熒光基團(tuán)的HUMO和LUMO軌道之間，當(dāng)被分析物不存在時(shí)，熒光基團(tuán)被激發(fā)后，識(shí)別基團(tuán)的HOMO軌道的電子轉(zhuǎn)移到熒光基團(tuán)的HOMO軌道，致使熒光基團(tuán)被激發(fā)到LUMO軌道上的電子無(wú)法回到基態(tài)而難以產(chǎn)生熒光，導(dǎo)致熒光淬滅，即PET1過程發(fā)生。 當(dāng)識(shí)別基團(tuán)與被分析物結(jié)合后，識(shí)別基團(tuán)HOMO軌道能量

9、降低，使PET過程受阻，這樣熒光基團(tuán)的激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)，熒光恢復(fù) 。 PET2 熒光團(tuán)對(duì)識(shí)別基團(tuán)的PET過程發(fā)生和受阻的前線軌道理論解釋 第二種是熒光基團(tuán)對(duì)識(shí)別基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移(PET2)，如上圖所示，即識(shí)別基團(tuán)的LUMO軌道介于熒光團(tuán)的HUMO和LUMO軌道之間，當(dāng)被分析物不存在時(shí)，熒光基團(tuán)被激發(fā)后，熒光基團(tuán)LUMO軌道上的電子轉(zhuǎn)移到就近的識(shí)別基團(tuán)的LUMO軌道上，無(wú)法回到其基態(tài)而難以產(chǎn)生熒光，導(dǎo)致熒光淬滅，即PET2過程發(fā)生。 當(dāng)被分析物與識(shí)別基團(tuán)結(jié)合后，識(shí)別基團(tuán)的LUMO的能量升高，PET過程受阻，熒光基團(tuán)的激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)，熒光恢復(fù)。 總的來(lái)說，識(shí)別基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移，

10、即識(shí)別基團(tuán)的HUMO軌道上的電子占據(jù)了熒光基團(tuán)的HOMO軌道；熒光基團(tuán)對(duì)識(shí)別基團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移(PET2),即識(shí)別基團(tuán)LUMO消耗掉了熒光基團(tuán)被激發(fā)的電子，兩者最終導(dǎo)致熒光基團(tuán)被激發(fā)的電子不能回到基態(tài)，使熒光被淬滅。2 、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移 （ICT，intramolecular charge transfer） 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移是指分子在激發(fā)態(tài)時(shí)發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，造成正負(fù)電荷分離，形成分子電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針分子通常是熒光團(tuán)上同時(shí)連有推電子基團(tuán)（電子給體，Donor）和吸電子基團(tuán)（電子受體，Acceptor）,通過鍵提供電子轉(zhuǎn)移的通道，形成強(qiáng)的推-拉作用的共軛體系，其吸電子基團(tuán)或推電子

11、基團(tuán)本身充當(dāng)識(shí)別基團(tuán)的一部分。當(dāng)識(shí)別基團(tuán)和被分析物結(jié)合后，作為識(shí)別基團(tuán)的供電子部分或拉電子部分的推拉電能力發(fā)生的改變，整個(gè)體系的的電子結(jié)構(gòu)重新分布，從而導(dǎo)致吸收光譜，發(fā)射光譜發(fā)生變化，主要是光譜紅移或藍(lán)移 。識(shí)別基團(tuán)分別為電子供體和電子受體的ICT過程光譜移動(dòng)示意圖（其中D、A分別表示電子給體和電子受體） 在ICT機(jī)理中，有一種情況被稱為扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT，twisted intramolecular charge transfer)，在具有推-拉電子共振體系的熒光分子中，如果推電子基(如二甲氨基)是通過單鍵與熒光基團(tuán)相連的，當(dāng)熒光團(tuán)被光激發(fā)后，由于強(qiáng)烈的分子內(nèi)光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致

12、原來(lái)與芳環(huán)共平面的電子給體繞單鍵旋轉(zhuǎn)，而與芳環(huán)平面處于正交狀態(tài)，原來(lái)的共振系統(tǒng)被破壞，使部分電荷轉(zhuǎn)移變?yōu)橥耆碾娮愚D(zhuǎn)移，形成TICT激發(fā)。 當(dāng)形成TICT激發(fā)時(shí)，原有的ICT熒光則被淬滅。TICT態(tài)通常不發(fā)射或發(fā)射較弱的長(zhǎng)波熒光，在少數(shù)情況下可出現(xiàn)ICT與TICT雙重?zé)晒猬F(xiàn)象。 化合物8是另一類香豆素?zé)晒馓结槪谙愣顾氐?號(hào)位以烯鍵連接了一個(gè)苯并拉電子基，7號(hào)位修飾了一個(gè)二乙胺基供電子基，構(gòu)成了推拉電子體系的熒光分子探針。當(dāng)羥基自由基存在時(shí)，能夠?qū)⒒衔?氧化為化合物9，這樣化合物9共軛度大大擴(kuò)大，氮原子帶正電荷增強(qiáng)了其拉電子能力，使整個(gè)體系p電荷離域程度增大，從而導(dǎo)致吸收光譜和熒光光譜分別紅

13、移了60 nm和156 nm，發(fā)射波長(zhǎng)已位于近紅外，基本不受樣品熒光背景的干擾，熒光顏色由綠色變?yōu)榧t色，該探針可對(duì)細(xì)胞中的羥基自由基進(jìn)行比率檢測(cè)，比率信號(hào)可達(dá)210倍。 8 93 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET, fluorescence resonace energy transfer） 熒光共振能量轉(zhuǎn)移指一個(gè)熒光體系含有兩個(gè)熒光團(tuán)，一個(gè)充當(dāng)能量供體D，另一個(gè)為能量受體A，當(dāng)用供體D的激發(fā)去激發(fā)熒光體系時(shí)，可以發(fā)生從D到A的非輻射能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)射出受體熒光團(tuán)的熒光。熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生必須具備以下幾個(gè)條件： （1）能量供體熒光團(tuán)D的熒光發(fā)射位于短波長(zhǎng)處，且發(fā)射光譜和能量受體熒光團(tuán)A的吸收光譜有

14、一定重疊，能量受體能夠在能量供體的發(fā)射波長(zhǎng)處吸收能量； （2）能量供體與能量受體相隔的距離必須遠(yuǎn)大于它們之間的碰撞直徑（有時(shí)甚至為70-100）； （3）能量供體與能量受體還必須以適當(dāng)?shù)姆绞脚帕小?化合物10是以氟硼熒和羅丹明為熒光團(tuán)設(shè)計(jì)的FRET熒光探針，由于氟硼熒的熒光發(fā)射光譜與羅丹明的吸收光譜有較大范圍重疊，通過連接臂連接，氟硼熒作為能量供體，羅丹明作為能量受體，加入被分析物后，熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程便能實(shí)現(xiàn)。加入汞離子之前，表現(xiàn)為氟硼熒的綠色熒光，汞離子的存在能促使氨基硫脲形成噁二唑酮類化合物而致使羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，此時(shí)氟硼熒的能量傳遞給羅丹明，最終使得共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生，氟硼熒的發(fā)射

15、峰減弱，從而發(fā)射出羅丹明的紅色熒光，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)汞離子的比率型檢測(cè)。 10 114 激基締合物/復(fù)合物（ excimer / exciplex ） 激基締合物指一些熒光團(tuán)在激發(fā)態(tài)與另一相同或不同的基態(tài)熒光團(tuán)接近時(shí)往往能生產(chǎn)激基締合物（通過-堆積作用形成激基締合物）可觀察到雙重?zé)晒?。它的發(fā)射光譜不同于單體的熒光，新的熒光會(huì)產(chǎn)生一定的紅移，且出現(xiàn)強(qiáng)而寬的，無(wú)精細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)射峰。這種作用本質(zhì)上是光致電荷轉(zhuǎn)移作用，在兩個(gè)相同的熒光分子之間形成激基締合物以及在兩個(gè)完全不同的熒光分子之間形成激基復(fù)合物，可以用下式表示：A* + A A*-A ( excimer )A* + B A*-B ( exciplex

16、) 激基締合物對(duì)距離的要求更為苛刻，只有激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子達(dá)到碰撞距離3 時(shí)才可能形成激基締合物，因此可以利用各種分子間作用力改變兩個(gè)熒光團(tuán)之間的距離，通過結(jié)合客體前后單體和激基締合物的熒光光譜的變化來(lái)表達(dá)客體被識(shí)別的信息。由于萘、芘、葸等熒光團(tuán)具有較長(zhǎng)的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成激基締合物等特點(diǎn)，因此常常被用于此類探針中。 化合物12基于激基締合物的熒光探針，加入汞離子之前兩個(gè)芘分子相距很遠(yuǎn)，因此發(fā)射的是芘單體熒光，當(dāng)汞離子存在時(shí)，O、N原子與其配位形成化合物13，從而拉近了兩個(gè)芘分子之間的距離，且讓其平行排列，最后產(chǎn)生二聚體熒光。 12 135、 有機(jī)載體在熒光分子探針中的應(yīng)用 羅丹明羅丹明

17、及其衍生物是一種氧雜蒽類熒光染料 ，由于苯環(huán)間氧橋的存在，從而分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)，開環(huán)狀態(tài)下，在激發(fā)光的作用下能產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收和熒光，其最大發(fā)射波長(zhǎng)位于500-700 nm之間，為紅色可見光區(qū)，可有效的避開生物體系背景熒光，從而能提高探針的靈敏度，因此是生物分析中經(jīng)常用到的熒光探針，具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。 羅丹明內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)具以下特點(diǎn)：1）羅丹明的內(nèi)酰胺螺環(huán)是非共軛結(jié)構(gòu)的，因此在長(zhǎng)波長(zhǎng)處無(wú)吸收，無(wú)色，無(wú)熒光；2）內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)在酸性條件或者與被分析物結(jié)合后能夠誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，氧雜蒽結(jié)構(gòu)電子重新排布，共軛結(jié)構(gòu)恢復(fù)，因此在長(zhǎng)波長(zhǎng)有吸收，有顏色，強(qiáng)熒光。由于此結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，羅丹明內(nèi)酰胺類衍生物是一類很好的OFF-ON型熒光傳感器熒光團(tuán)。因此可以用羅丹明作為母體來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)，首先使它形成具有酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，當(dāng)它與被分析物作用時(shí)，內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，信號(hào)從無(wú)到有，達(dá)到對(duì)被分析物的識(shí)別的目的。 14 15 芘芘分子由四個(gè)苯環(huán)構(gòu)成，是一種四環(huán)多環(huán)芳香類物質(zhì)，有很強(qiáng)的熒光，在丙酮中量子產(chǎn)率可達(dá)0.99，其晶體加電壓可發(fā)光，最初用于電致發(fā)光研究。芘熒光基團(tuán)是最有用的熒光化學(xué)敏感