分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)

1、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)第一節(jié)分子標(biāo)記的類型和作用原理遺傳標(biāo)記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。在遺傳學(xué)研究中，遺傳標(biāo)記主要應(yīng)用于連鎖分析、基因定位、遺傳作圖及基因轉(zhuǎn) 移等。在作物育種中，通常將與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記用來對目標(biāo)性狀進(jìn)行 追蹤選擇。在現(xiàn)代分子育種研究中，遺傳標(biāo)記主要用來進(jìn)行基因定位和輔助選擇。1、形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀。如、株高、穗型、粒色 等的相對差異。形態(tài)標(biāo)記數(shù)量少，可鑒別標(biāo)記基因有限，難以建立飽和的遺傳圖譜。有些形態(tài)標(biāo)記受環(huán)境

2、的影響，使之在育種的應(yīng)用中受到限制。2、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是指能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。如染色體的結(jié)構(gòu)特 征和數(shù)量特征。核型：染色體的長度、著絲粒位置、隨體有無。 可以反映染色體的缺失、重復(fù)、倒位、易位。染色體結(jié)構(gòu)特征帶型：染色體經(jīng)特殊染色顯帶后，帶的顏色深淺、寬窄 和位置順序，可以反映染色體上常染色質(zhì)和異染 色質(zhì)的分布差異。染色體數(shù)量特征一是指細(xì)胞中染色體數(shù)目的多少。染色體數(shù)量上的遺傳多態(tài)性包括整倍體和非整倍體變異細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 優(yōu)點：克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點。 缺點：（ 1）培養(yǎng)這種標(biāo)記材料需花費大量的人力物力；（ 2）有些物種對對染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異的耐受性差， 難以獲得

3、相應(yīng)的標(biāo)記材料； （3）這種標(biāo)記常常伴有對生物有害的表型效應(yīng)；（4）觀察鑒定比較困難。3、蛋白質(zhì)標(biāo)記用作遺傳標(biāo)記的蛋白質(zhì)分為酶蛋白質(zhì)和非酶蛋白質(zhì)兩種。非酶蛋白質(zhì)：用種子儲藏蛋白質(zhì)經(jīng)一維或二維聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)顯示的蛋 白質(zhì)譜帶或點，確定其分子結(jié)構(gòu)和組成的差異。酶蛋白質(zhì)：利用非變性淀粉凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳及特異性染色檢測，根據(jù)電 泳譜帶的不同來顯示酶蛋白在遺傳上的多態(tài)性。蛋白質(zhì)標(biāo)記的不足之處：（1）每一種同工酶標(biāo)記都需特殊的顯色方法和技術(shù)；（2）某些酶的活性具有發(fā)育和組織特異性；（3）標(biāo)記的數(shù)量有限。4 、 DNA 標(biāo)記DNA分子標(biāo)記是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。DNA水平的遺傳

4、多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸系列的任何差異，包括單個核苷酸的變異、分子標(biāo)記的類型及作用原理三大類：(1) 基于DNAr DNA雜交的DNA標(biāo)記利用限制性內(nèi)切酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之進(jìn)行雜交，通過放射性自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性。(2) 基于PCM DNA標(biāo)記根據(jù)所用引物的特點分為隨機(jī)引物 PCR標(biāo)記和特異引物PCF標(biāo)記。(3) 基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記何謂 PCR？聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction) 簡稱 PCR 是一項在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCF原 理類似于DNA

5、勺體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增 DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物 冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火 引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。？這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個 PCR 循環(huán)，PCF就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。三個基本步驟 : 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94C下解鏈 ;(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50C左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適 溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理

6、論上每一輪循環(huán)將使目的 DNA擴(kuò)增一倍,這些 經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使DNAT增 達(dá)倍。PCR 反應(yīng)中的主要成份1. 引物2. 4 種三磷酸脫氧核苷酸 (dNTP)3. Mg2+4. 模板 DNA5. Taq DNA 聚合酶6. 反應(yīng)緩沖液 遺傳性疾病的基因診斷在臨床醫(yī)學(xué)上，PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒、病菌感染。 法醫(yī)學(xué)個人識別、親子鑒定1985 年，英國遺傳學(xué)家 Jeffreys 采用 DNA 指紋圖譜進(jìn)行個人識別和親子鑒定。?有時犯罪物證量很少，不足以用來進(jìn)行 DNA旨紋分析，PCRt效解決這些問 題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物

7、物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析， 在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCF技術(shù)被普遍采用。植物遺傳育種構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、基因定位 分子標(biāo)記輔助育種了解不同品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化畜牧 畜禽病診斷 : 豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性 腹瀉病毒、免疫缺陷病毒等檢測性別鑒定：牛、綿羊 Y染色體上特異DNA片段構(gòu)建基因圖譜 檢測基因整合與表達(dá)：轉(zhuǎn)基因魚植物保護(hù) 病原微生物的基因型鑒定 植物病原微生物分類 形態(tài)學(xué)上相似性和潛在的血清學(xué)交互反應(yīng)，用常規(guī)方法難以區(qū)分，采用反轉(zhuǎn)錄 PCF(RT-PCR可準(zhǔn)確快速區(qū)分.理想的DNA標(biāo)記的應(yīng)具備以下特點

8、:(1) 表現(xiàn)穩(wěn)定；2）數(shù)量多；3）多態(tài)性高；4）對目標(biāo)性狀表達(dá)無不良影響；5）部分標(biāo)記的遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體和雜合體；6）信息量大，分析效率高；7）檢測手段簡單快捷，易于實現(xiàn)自動化；8）開發(fā)成本和使用成本低。引物長度為910個堿基。由于引物較短，在PCR中必須使用較低的退火溫度，以保證引物能與模板DNA吉合。RAPD標(biāo)記的優(yōu)點：對DNA需要量極少；對DNA的質(zhì)量要求不高；操作簡單易行； 一套引物可用于不同生物的基因組分析。AFLP標(biāo)記優(yōu)點：可靠、高效?？稍谝粋€反應(yīng)內(nèi)檢測大量限制性片段。不足：需用同位素或非同位素標(biāo)記引物，較費時耗材。三個步驟DNA?酶切及人工接頭連接，對提取 DNA

9、質(zhì)量要求較高，需避免其它 DNA污染和 抑制物質(zhì)的存在；（2）擴(kuò)增反應(yīng)；（3）通常在 4-6 的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離(四)SSR標(biāo)記( Simple sequence Repeat ) =(microsatellite)=(Short Tandem Repeat,STR) 簡單序列重復(fù)標(biāo)記優(yōu)點：多態(tài)性豐富；操作簡便，穩(wěn)定可靠 缺點：依賴測序設(shè)計引物，開發(fā)成本高。第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因 連鎖標(biāo)記的篩選技術(shù)分子標(biāo)記為實現(xiàn)對基因型的直接選擇提供了可能，因為分子標(biāo)記的基因型是可以 識別的。如果目標(biāo)基因與某個分子標(biāo)記緊密連鎖，那么通過分子標(biāo)記基因型的檢測，就能 獲知目標(biāo)基因的基因型。因此，可以借助分

10、子標(biāo)記對目標(biāo)性狀的基因型進(jìn)行選擇，這稱為分子標(biāo)記輔助選 擇（ MAS）。用于MAS育種的分子標(biāo)記需具備的條件:1 分子標(biāo)記與目標(biāo)基因緊密連鎖;2 標(biāo)記適用性強(qiáng)，重復(fù)性好；3 .不同遺傳背景選擇有效.一、遺傳圖譜的構(gòu)建 主要環(huán)節(jié):1、根據(jù)遺傳材料的多態(tài)性確定親本組合，建立作圖群體；2、群體中不同植株的標(biāo)記基因型分析；3、用計算機(jī)程序構(gòu)建連鎖群。暫時性分離群體: F2、F3、F4、三交群體等。BC兩類分離群體 永久性分離群體：RIL、DH群體等。二、近等基因系（NIL）的培育近等基因系：一組遺傳背景相同或相近，只是在個別染色體區(qū)段上存在差異的株 系。如果一對近等基因系在目標(biāo)性狀上表現(xiàn)差異，那么，凡

11、是能在這對近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記，就可能位于目標(biāo)基因的附近。近等基因系是一系列回交過程的產(chǎn)物三、利用群體分離法進(jìn)行性狀標(biāo)記利用 NIL 尋找質(zhì)量性狀基因的分子標(biāo)記的基本策略是比較輪回親本、 NIL 及供體 親本三者的標(biāo)記基因型。當(dāng) NIL 與供體親本具有相同的標(biāo)記基因型，但與輪回親本的標(biāo)記基因型不同時， 則該標(biāo)記基因就可能與目標(biāo)基因連鎖。四、數(shù)量性狀的基因定位控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置稱為數(shù)量性狀基因座（ QTL）利用分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖遺傳分析，可以檢測出QTL即QTL定位（QTLmapping） 第三節(jié)作物MAS育種一、作物MAS育種需具備的條件1、分子標(biāo)記與目標(biāo)基因共分離或緊密連鎖；2、具有在大群體中利用分子標(biāo)記進(jìn)行篩選的有效手段（ PCR；3、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)、簡單、易操作；4、有相應(yīng)的計算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件。二、MASt種方