丹參提取液對HMGB1胞外釋放的抑制作用

1、丹參提取液對HMGB1胞外釋放的抑制作用         11-03-24 10:12:00     編輯：studa20                作者：王婷婷 徐明，陳國千 王春新 倪芳穎 帥朝霞【摘要】  目的： 研究丹參對內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）激活后巨噬細(xì)胞高遷移率族

2、蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）釋放和內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平的影響。方法： 使用不同濃度的丹參提取液處理100 ng/ml LPS激活的培養(yǎng)巨噬細(xì)胞株RAW 264.7，觀察培養(yǎng)上清液中HMGB1水平和細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)的變化，并通過腹腔內(nèi)注射LPS建立的內(nèi)毒素血癥小鼠模型，觀察丹參提取液對內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平和存活率的影響。細(xì)胞培養(yǎng)上清液和血清HMGB1含量采用酶聯(lián)免疫分析方法檢測，細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)采用RTPCR方法檢測。結(jié)果： 丹參提取液明顯抑制LPS激活后的巨噬細(xì)胞HMGB1釋放和HMGB1 mRNA

3、表達(dá)，降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平并提高存活率。結(jié)論： 丹參有抑制巨噬細(xì)胞HMGB1釋放和保護(hù)內(nèi)毒素血癥小鼠的作用。 【關(guān)鍵詞】  丹參； 高遷移率族蛋白B1； 巨噬細(xì)胞； 內(nèi)毒素血癥AbstractObjective: To study the effects of Salvia miltiorrhiza on the release of high mobility group box 1(HMGB1) from endotoxinstimulated macrophages and serum HMGB1 level of endotoxemia mice. Metho

4、ds： HMGB1 concentration in the culture medium and expression of HMGB1 mRNA were analysed by enzymelinked immunosorbent assay and RTPCR, respectively, after 100 ng/ml lipopolysaccharide(LPS)stimulated macrophagelike RAW 264.7 cells were treated with different doses of Salvia miltiorrhiza extract. In

5、addition, the effect of Salvia miltiorrhiza extract was investigated on serum HMGB1 level and survival rate of endotoxemia mice which were established by intraperitoneal injection of LPS. Results： Salvia miltiorrhiza extract markedly suppressed the release of HMGB1 and expression of HMGB1 mRNA in LP

6、Sstimulated macrophages, and decreased serum HMGB1 level of endotoxemia mice with  the survival rate elevated. Conclusion： Salvia miltiorrhiza suppressed extracellular release of HMGB1 in endotoxinstimulated macrophages, and conferred protection against endotoxin lethality.Key wordsSalvia milti

7、orrhiza;  high mobility group box 1;  macrophages;  endotoxemia胞外高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）為近年發(fā)現(xiàn)的一種晚期炎癥介質(zhì)，在膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎、急性胰腺炎等疾病的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用1-4。鑒于HMGB1在諸多炎癥性疾病病理中的重要性，HMGB1靶向治療研究已引起廣泛重視3,4。丹參(Salvia miltiorrhiza)為唇形科鼠尾草屬植物的干燥根及根莖，具有活血通經(jīng)、涼血消腫、祛癰腫丹毒之功效5,6。我們在篩選中藥抗HMGB1

8、成分研究中發(fā)現(xiàn)丹參提取液具有明顯抑制巨噬細(xì)胞HMGB1釋放和保護(hù)內(nèi)毒素血癥小鼠的作用，現(xiàn)報告如下。    1  材料與方法    1.1  實驗材料    BALB/c小鼠（68周，雄性，2025 g）由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供；丹參購自甘肅天水藥材供應(yīng)站(經(jīng)無錫市人民醫(yī)院許英華主任藥師鑒定)；巨噬細(xì)胞株RAW 264.7購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）為Sigma公司產(chǎn)品，mRNA提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，MMLV一步

9、法RTPCR試劑盒為上海捷瑞公司產(chǎn)品。    1.2  方法1.2.1  丹參提取液的制備 丹參經(jīng)純水漂洗后，水煎2次，合并2次水煎液，0.2 m過濾器過濾并調(diào)整濃度至1 g/ml(按生藥計算)。1.2.2  HMGB1濃度測定 采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）方法。小鼠HMGB1 ELISA試劑盒為武漢中美科技有限公司產(chǎn)品，按產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行。1.2.3  HMGB1 mRNA表達(dá)檢測 應(yīng)用mRNA提取試劑盒，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中直接裂解細(xì)胞mRNA。HMGB1引物（擴(kuò)增片段為680 bp）：5AT

10、GGGCAAAGGAGATCCTA3（上游），5ATTCATCATCATCATCTTCT3（下游）。以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）作為內(nèi)參對照，引物（擴(kuò)增片段為309 bp）：5TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3（上游），5AGATCCACAACGGATACATT3（下游）。HMGB1 mRNA 表達(dá)水平以HMGB1與GADPH基因擴(kuò)增條帶光密度（D）比值表示。1.2.4  培養(yǎng)細(xì)胞實驗 巨噬細(xì)胞株RAW 264.7使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天傳代1 次。細(xì)胞貼壁覆蓋80%90%時進(jìn)行實驗。以LPS（10

11、0 ng/ml培養(yǎng)液)為刺激劑，以不同濃度的丹參提取液（10，30，100 mg/ml)為保護(hù)劑，置于巨噬細(xì)胞株RAW 264.7培養(yǎng)物中，培養(yǎng)20 h后測定培養(yǎng)上清液中HMGB1水平。實驗重復(fù)4次。1.2.5  動物實驗 取BALB/c小鼠50只，以5 mg/kg劑量于小鼠腹腔內(nèi)注射LPS建立小鼠內(nèi)毒素血癥模型，隨機(jī)分為內(nèi)毒素血癥（對照）組和丹參處理組各25只，后者于注射LPS后0，24，48，72 h以15 g/kg劑量給小鼠腹腔內(nèi)注射丹參提取液，觀察小鼠存活情況。1.3  統(tǒng)計學(xué)方法    采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行雙側(cè)t檢驗分析和2檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。    2  結(jié)果2.1  丹參提取液對巨噬細(xì)胞HMGB1釋放的作用    丹參提取液（30，100 mg/ml）明顯抑制LPS激活后巨噬細(xì)胞株RAW 264.7 HMGB1的釋