高效液相色譜儀的使用和不易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性分析

1、華南師范大學(xué)實驗報告學(xué)生姓名:黃敬霞學(xué)號:20092401147專業(yè):化學(xué)師范年級、班級:09級化四課程名稱:近代有機(jī)分析方法和實驗實驗時間:2011年10月12日高效液相色譜儀的使用和不易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性分析一、實驗?zāi)康?1、學(xué)習(xí)使用高效液相色譜儀,掌握保留時間的概念和定性分析2、通過對樣品的定性測定,初步掌握獲得高效液相色譜圖和數(shù)據(jù)的一般操作程序與技術(shù)二、實驗原理:高效液相色譜分是由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部份組成。由于樣品溶液中的各組分在色譜柱中兩相中的分配系數(shù)不同,當(dāng)試樣隨流動相進(jìn)入色譜柱后,組分就在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配,由于固定相對各種組分的吸附能力不同

2、,各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同,經(jīng)過一定柱長后彼此分離,依次從色譜柱流出,通過檢測器時樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。三、實驗儀器與試劑:1、儀器:島津液相色譜儀,SPD-20A檢測器,LC-20AT泵,微量進(jìn)樣器,C18色譜柱2、試劑:煙酸乙酯,甲醇(AR,色譜純,超純水四、實驗步驟:1、準(zhǔn)備1.1準(zhǔn)備所需的流動相,用合適的0.45m濾膜過濾,超聲脫氣20min。(這里用的是流動相是甲醇(B和超純水(A,分別用有機(jī)相系和水相系的0.45µm濾膜過濾,超聲脫氣20min。1.2根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱(注意方向和定量環(huán)。1.3配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶

3、液(也可在平衡系統(tǒng)時配制,用合適的0.45m濾膜過濾。(即用移液管量取0.5 mL的煙酸乙酯用甲醇定容在5 mL的容量瓶中(105ppm,然后用移液管量取1 mL剛定容的溶液并用甲醇稀定容在10mL的容量瓶后(104 ppm并用移液管量取1 mL剛定容的溶液并用甲醇稀定容在10mL的容量瓶中,這樣就配制成濃度為1000ppm,用0.45µm有機(jī)濾膜過濾。1.4檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。2、開機(jī)接通電源,依次開啟不間斷電源、B泵、A泵、檢測器,待泵和檢測器自檢結(jié)束后,打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī),最后打開色譜工作站(即電腦桌面上的CS-Light Real

4、Time Analysis。3、參數(shù)設(shè)定3.1波長設(shè)定:在檢測器顯示初始屏幕時,按func鍵接著按Enter鍵,用數(shù)字鍵輸入所需波長值245nm,按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出到初始屏幕。3.2流速設(shè)定:在A泵顯示初始屏幕時,按func鍵,用數(shù)字鍵輸入所需的流速(柱在線時流速一般不超過1ml/min,按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出。3.3流動相比例設(shè)定:在A泵顯示初始屏幕時,按conc鍵,用數(shù)字鍵輸入流動相B的濃度百分?jǐn)?shù)(80%,按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出。4、更換流動相并排氣泡4.1將A/B管路的吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動相的儲液瓶中;4.2逆時針轉(zhuǎn)動A/B泵的排液閥180

5、6;,打開排液閥;4.3按A/B泵的purge鍵,pump指示燈亮,泵大約以9.9ml/min的流速沖洗,3min(可設(shè)定后自動停止;4.4將排液閥順時針旋轉(zhuǎn)到底,關(guān)閉排液閥。4.5如管路中仍有氣泡,則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。4.6如按以上方法不能排盡氣泡,從柱入口處拆下連接管,放入廢液瓶中,設(shè)流速為5ml/min,按pump鍵,沖洗3min后再按pump鍵停泵,重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。5、平衡系統(tǒng)5.1按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開"在線色譜工作站"軟件,輸入實驗信息并設(shè)定各項方法參數(shù)后,按下"數(shù)據(jù)收集"頁的 查看基線 按鈕。5.2等

6、度洗脫方式5.2.1按A泵的pump鍵,A、B泵將同時啟動,pump指示燈亮。用檢驗方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng),一般最少需6倍柱體積的流動相。按A泵的pump鍵,A、B泵將同時啟動,pump 指示燈亮。用檢驗方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng),一般最少需6倍柱體積的流動相。5.2.2檢查各管路連接處是否漏液,如漏液應(yīng)予以排除。5.2.3觀察泵控制屏幕上的壓力值,壓力波動應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡,按4.6操作。5.2.4觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移<0.01mV/min,噪聲為<0.001mV時,可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài),可以進(jìn)樣。6、進(jìn)樣6.1進(jìn)樣前在CS-L

7、ight Real Time Analysis中:(1點(diǎn)擊“單次分析”,接著點(diǎn)擊“樣品記錄”,在樣品記錄名稱中輸入所要檢測得樣品名稱,然后點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)文件”選擇該樣品儲存在哪里,最后在“數(shù)據(jù)儲存的文件夾”后面輸入該樣品名稱,點(diǎn)擊確定。(2在信號采集菜單中設(shè)定停止時間(6 min和延遲時間(3 min。6.2進(jìn)樣前按檢測器zero鍵調(diào)零,按軟件中 零點(diǎn)校正 按鈕校正基線零點(diǎn),再按一下查看基線 按鈕使其彈起。6.3用試樣溶液清洗注射器,并排除氣泡后抽取20 L。6.4進(jìn)樣時先注入注射器后向逆時針扳動進(jìn)樣閥的板扣后注入溶液再向順時針扳動進(jìn)樣閥后取出注射器。7、數(shù)據(jù)處理7.1在桌面雙擊“CS-Light

8、 Postrum Analysis”,點(diǎn)擊確定按鈕后,在“文件夾目錄中”選中該樣品記錄雙擊鼠標(biāo),在譜圖上單擊鼠標(biāo)右鍵的“顯示設(shè)置”,在“顯示設(shè)置”中選擇“展開色譜”的“時間”填寫“0”到“20”后點(diǎn)擊確定7.2用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“編輯”選擇“積分”中的“最小峰面積/高”輸入“最小峰面積值”,然后點(diǎn)擊“查看”。7.3復(fù)制譜圖到Word文檔,在譜圖中點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵選擇“復(fù)制”;復(fù)制數(shù)據(jù),單擊鼠標(biāo)左鍵全選,然后鼠標(biāo)右鍵“復(fù)制表格到剪貼板(b”。8、關(guān)閉儀器分析完畢后,關(guān)閉色譜工作站,再自上而下關(guān)閉儀器。五、數(shù)據(jù)記錄甲醇的液相色譜圖 0.0 2.5 5.07.510.012.515.017.5min0.01.0

9、2.03.04.05.06.07.08.0V(x100,000煙酸乙酯的液相色譜圖 0.0 2.5 5.07.510.012.515.017.5min0.01.02.03.04.05.06.07.0V(x100,0004.303 六、結(jié)果分析及討論定性分析:在液相色譜分析中,當(dāng)實驗條件設(shè)置在合適位置并保持不變的時候,在樣品能保證檢測的前提下,對實驗結(jié)果影響最大的就是實驗過程中實驗者的操作是否標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范。一般說來,整個實驗過程中進(jìn)樣操作應(yīng)由同一人進(jìn)行,以防個體操作差異而引起實驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)誤差。本實驗運(yùn)用液相色譜法對煙酸乙酯進(jìn)行定性分析,其中流動相是選用甲醇與水的8:2混合液,在該液相色譜實驗中,甲

10、醇無(強(qiáng)吸收峰,利于樣品的檢測。在樣品進(jìn)樣后4.303min 處出現(xiàn)一強(qiáng)吸收峰,利用保留時間能方便快捷判斷出樣品,該峰屬于煙酸乙酯。七、思考題1、液相色譜法和氣相色譜法有何區(qū)別?答:高效液相色譜分析法(HPLC,它的基本概念及理論基礎(chǔ)(如保留值、塔板理論、速率理論、容量因子、分離度等,與氣相色譜是一致的,但又有不同之處:高效液相色譜與氣相色譜的主要區(qū)別可歸結(jié)于以下幾點(diǎn):(1進(jìn)樣方式的不同:高效液相色譜只要將樣品制成溶液,而氣相色譜需加熱氣化或裂解;(2流動相的不同,在被測組分與流動相之間、流動相與固定相之間都存在著一定的相互作用力;(3由于液體的粘度較氣體大兩個數(shù)量級,使被測組分在液體流動相中

11、的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體流動相中約小45個數(shù)量級;(4由于流動相的化學(xué)成分可進(jìn)行廣泛選擇,并可配置成二元或多元體系,滿足梯度洗脫的需要,因而提高了高效液相色譜的分辨率(柱效能;(5高效液相色譜采用510Lm細(xì)顆粒固定相,使流體相在色譜柱上滲透性大大縮小,流動阻力增大,必須借助高壓泵輸送流動相;(6高效液相色譜是在液相中進(jìn)行,對被測組分的檢測,通常采用靈敏的濕法光度檢測器,例如,紫外光度檢測器、示差折光檢測器、熒光光度檢測器等;(7液相色譜與氣相色譜相比較,高效液相色譜同樣具有高靈敏度、高效能和高速度的特點(diǎn)。高效液相色譜的定性和定量分析,與氣相色譜分析相似,在定性分析中,采用保留值定性,或與其他定性能

12、力強(qiáng)的儀器分析法連用;在定量分析中,采用測量峰面積的歸一化法、內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法等,但高效液相色譜在分離復(fù)雜組分式樣時,有些組分常不能出峰,因此歸一化法定量受到限制,而內(nèi)標(biāo)法定量則被廣泛使用。3、色譜分離方式應(yīng)如何選擇?答:(1根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇低相對分子質(zhì)量(400的試樣因其揮發(fā)性強(qiáng),宜采用氣相色譜分離;相對分子質(zhì)量大于2000的化合物可采用液相色譜分離;相對分子質(zhì)量介于1002000范圍內(nèi)的分子,應(yīng)視試樣性質(zhì)選用液-固吸附色譜、液-液分配色譜或離子交換色譜分離。(2根據(jù)溶解性選擇水溶性離子化合物與共價化合物可分別采用離子交換色譜或液-液分配色譜分離。對于非水溶性化合物,若易溶于烴類溶劑,可采用液-固吸附色譜分離;若溶于二氯甲烷或氯仿,可采