紙層析法分離氨基酸實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、 前言紙層析法 紙層析法又稱紙色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。本世紀(jì)初俄國(guó)植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素?，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。它是一種以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動(dòng)相為不與水相溶的有機(jī)溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點(diǎn)在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開(kāi)。當(dāng)組分移動(dòng)一定距離后，各組分移動(dòng)距離不同，最后形成互相分離的斑點(diǎn)。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點(diǎn)位置。根據(jù)組分移動(dòng)距離（Rf值）與已知

2、樣比較，進(jìn)行定性。用斑點(diǎn)掃描儀或?qū)⒔M分點(diǎn)取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。紙層析法（paper chromatography）是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測(cè)定；也是定性或定量測(cè)定多肽、核酸堿基、糖、有機(jī)酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分離分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機(jī)溶溶劑是流動(dòng)相。在環(huán)境分析測(cè)試中，有時(shí)用紙層析法分離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC應(yīng)用普遍。在做葉綠體色素分離時(shí)用到,將葉片碾碎，浸出綠

3、色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對(duì)含量和種類。紙層析法一般用于葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b，它們?cè)趯游鲆褐械娜芙舛炔煌?，溶解度大的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法能清楚地將葉綠體中的色素分離。圖1 葉綠素的分離氨基酸 氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，廣泛用于食品、醫(yī)藥、添加劑及化妝品行業(yè)。隨著生物工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展逐漸成為2l世紀(jì)全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需求量越來(lái)越大

4、，品種變更越來(lái)越快，工藝改革越來(lái)越新。目前全世界氨基酸每年的產(chǎn)量為100萬(wàn)噸，而需求總量是800萬(wàn)噸。我國(guó)自20世紀(jì)60年代起，氨基酸的應(yīng)用在食品工業(yè)占61，在飲料工業(yè)占30，醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人類生活的很多方面都有著應(yīng)用：(1)在食品行業(yè)的應(yīng)用(2) 在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用(3) 在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用(4) 在化妝品行業(yè)的應(yīng)用(5) 在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用(6) 在其他行業(yè)的應(yīng)用氨基酸工業(yè)還有著廣闊的發(fā)展前景：(1) 傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法 (2) 運(yùn)用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸 (3) 大力發(fā)展藥用中間體,具體為：氨基酸及其衍生物逐漸成為藥

5、用中間體 非天然氨基酸是合成活性藥物的重要原料 生產(chǎn)高附加值的非天然氨基酸 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色）。 (2)學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 (1)紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流過(guò)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。 (2)溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用比移值Rf值表示。 (3)Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。 (4)在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)

6、構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。材料與方法三、實(shí)驗(yàn)裝置與試劑 (1)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。 (2)80%甲醇 (3)0.1%茚三酮丙酮溶液 (4)氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL) (5)正丁醇實(shí)驗(yàn)儀器 (1)新華濾紙×1 (2)培養(yǎng)皿×1 (3)電熱鼓風(fēng)干燥箱×1 (4)吹風(fēng)機(jī)×1 (5)毛細(xì)管×4 （6）針、線、尺×1 （7）鐘罩(高約430mm,直徑約290mm，具磨口塞)×1實(shí)驗(yàn)操作 (1)濾紙 選用國(guó)產(chǎn)新華 1號(hào)濾紙

7、， 6cm×7cm。在距濾紙2cm處劃線，用鉛筆在線上標(biāo)上四個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣位子（留出縫線空間）。 （2）點(diǎn)樣 點(diǎn)樣要合適，樣品點(diǎn)的太濃，斑點(diǎn)易擴(kuò)散或拉長(zhǎng)，以致分離不清。用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點(diǎn)樣處的中心，這時(shí)樣品就自動(dòng)流出。點(diǎn)樣的擴(kuò)散直徑控制在0.5cm之內(nèi)，點(diǎn)樣過(guò)程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴，為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，但要注意溫度不可過(guò)高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果。將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的兩邊不要接觸。避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動(dòng)特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。 (3)展層 將揉成圓筒狀的濾紙放

8、入培養(yǎng)皿內(nèi) (注意濾紙不要碰皿壁)，當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿位置。 酸溶劑系統(tǒng)： 正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml。溫度25，時(shí)間1h。 注意：使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。 （4）顯色 待展層基本結(jié)束后, 置65鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點(diǎn)。（5）Rf值的計(jì)算 用尺測(cè)量顯色斑點(diǎn)的中心與原點(diǎn)(點(diǎn)樣中心)之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求出此值，即得氨基酸的Rf值。四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄及處理1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果脯氨酸甘氨酸亮氨酸待測(cè)氨基酸原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離35mm20mm

9、56mm21mm，35mm57mm原點(diǎn)到溶劑前沿的距離75mm74mm75mm75mmRf0.467mm0.270mm0.747mmO.280mm0.467mm 0.760mm 判斷待測(cè)氨基酸脯氨酸甘氨酸亮氨酸甘氨酸，脯氨酸，亮氨酸表1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄五、討論1、注意事項(xiàng) (1)使用茚三酮顯色法，必須在整個(gè)層析操作中避免手直接接觸層析紙，因?yàn)槭稚铣３Ｓ猩倭亢镔|(zhì)。顯色時(shí)它也呈現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。污染了層析結(jié)果，因此操作時(shí)應(yīng)戴橡皮手套或指套。同時(shí)也要防止空氣中的氨。 (2)點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大，防止層析后氨基酸斑點(diǎn)過(guò)度擴(kuò)散和重疊，且點(diǎn)樣后吹風(fēng)溫度不宜過(guò)高，以免樣品變性(斑點(diǎn)發(fā)黃)。 (3)展層開(kāi)始時(shí)切勿使樣

10、品點(diǎn)浸入溶劑中。 (4)展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結(jié)果。2.思考 (1)為什么在展層時(shí)有時(shí)用一種溶劑系統(tǒng)，而有時(shí)用兩種溶劑系統(tǒng)? 這是根據(jù)Nernst在1891年提出的分配定律：一種溶質(zhì)在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)，即分配系數(shù)(Kd)。             Kd=Ca/Cb Ca和Cb是互不相溶的兩相，即A相和B相的濃度。這里的兩相可以使固相、液相和氣相。意思就是溶質(zhì)在A和B兩

11、種溶劑組成的混合溶劑里分配時(shí)，分配比是恒定的。 (2)酸性溶劑系統(tǒng)(或堿性溶劑系統(tǒng))對(duì)氨基酸極性基團(tuán)的解離有何影響? 酸性溶液中，有利于氨基酸的堿式電離，氨基結(jié)合質(zhì)子，整個(gè)分子帶正電荷；反之，堿性溶液中有利于羧基的酸式電離，氨基酸分子整體帶負(fù)電荷。 (3)酸性溶劑系統(tǒng)(或堿性溶劑系統(tǒng))對(duì)堿性氨基酸(賴、精、組)和 酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影響? 酸性溶劑系統(tǒng)對(duì)堿性氨基酸的溶解性加強(qiáng)，在層析過(guò)程中易溶于流動(dòng)相。所以跑得比較快，因此Rf值增大。反之，堿性性溶劑系統(tǒng)中酸性氨基酸Rf值增大。（4）什么是分配系數(shù)？ 在平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。 六、參考文獻(xiàn) 1 楊麗，尤麗，葉金秀，