淺論舌發(fā)育異常與胎鼠地塞米松腭裂的關(guān)系

1、淺論舌發(fā)育異常與胎鼠地塞米松腭裂的關(guān)系         【摘要】  目的：本實(shí)驗(yàn)通過小鼠胚胎腭裂模型制備，探討地塞米松對胎鼠舌體高度、寬度及舌肌黏膜厚度的影響。方法：選取孕鼠30只，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組于11.5GD腹腔注射地塞米松，對照組注射等量生理鹽水。獲取13.5GD16.5GD的腭裂胚胎模型，取其頭部Bouins液固定，石蠟包埋，標(biāo)準(zhǔn)顱頜冠狀位5m連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色和bcl2免疫組化染色。光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：1.bcl2陽性信號呈棕褐色顆粒，存在于核

2、膜周圍及胞漿中。2.實(shí)驗(yàn)組、對照組中不同時(shí)期橫行舌肌與縱行舌肌數(shù)量比例不同，13.5GD縱行舌肌數(shù)量較多，16.5GD橫行、垂直舌肌數(shù)量較多。3.同一時(shí)期，實(shí)驗(yàn)組舌體高度明顯高于對照組。結(jié)論：地塞米松誘導(dǎo)的胎鼠腭裂的發(fā)生與舌發(fā)育異常有關(guān)，而且舌體高度在一定程度上參與了腭裂的形成過程。 【關(guān)鍵詞】  腭裂;小鼠;地塞米松；舌??；bcl2 小鼠腭裂的形成受多方面因素的影響，其中胎鼠腭發(fā)育的異常、舌發(fā)育的異常等均參與了腭裂的形成過程。其中胎鼠腭發(fā)育的異常我們已研究過1,2，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討舌的發(fā)育過程及其發(fā)育異常對腭裂形成的影響。   1  材料與方法

3、   1.1  實(shí)驗(yàn)試劑與器械   試劑：醋酸地塞米松、Bouins固定液、蘇木精伊紅染液、兔bcl2多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。   儀器：OLYNPUS CX31，Motic 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。   1.2  實(shí)驗(yàn)動物與方法   健康成年未生育昆明小鼠，體重2225g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供，下午600雌雄21合籠，次日早730和下午430檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓之日定為孕期第0天（0GD，gestation day）。所得

4、孕鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組。實(shí)驗(yàn)組孕鼠于11.5GD腹腔注射50mg/kg劑量的地塞米松，對照組注射等量生理鹽水。各組均在13.5GD、14.5GD、15.5GD、16.5GD頸椎脫臼處死，取出胚胎，共得到胎鼠284只，其中實(shí)驗(yàn)組196只，對照組98只。取頭Bouins液固定，以喙部向下做定向石蠟包埋、5m連續(xù)冠狀位切片。   1.3  染色   HE染色：二甲苯脫蠟、梯度酒精、蒸餾水洗。蘇木精染色5min、鹽酸酒精分化、伊紅染色2min、梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片。   免疫組化染色：常規(guī)脫蠟至水；抗原修復(fù)3min；0

5、.01mmol/L PBS液洗3min×3次；3%H2O2 室溫避光孵育15min；0.01mmol/L PBS液洗3min×3次；5%BSA封閉。加入bcl2（1100），濕盒中4孵育過夜。其他步驟按即用型SABC免疫組化試劑盒使用說明書進(jìn)行。蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化、藍(lán)化、脫水、透明、封片。光鏡觀察舌體高度、舌體寬度及舌黏膜厚度的變化。   1.4  數(shù)據(jù)處理   用OLYMPUSCX31顯微鏡連接在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行觀察：各組中每只動物隨機(jī)選取同一解剖平面，10倍目鏡下統(tǒng)計(jì)測量舌體高度、舌體寬度及舌黏膜厚度，以SPSS統(tǒng)計(jì)軟

6、件進(jìn)行ANOVA方差分析。    2  結(jié)果   2.1  舌體的形態(tài)學(xué)觀察   舌由表面的黏膜和深部的舌肌組成。舌肌由縱行、橫行及垂直走向的骨骼肌纖維束交織構(gòu)成，縱行肌所占比例最多，垂直肌次之，橫行肌最少。在舌的不同生長發(fā)育階段，舌肌的縱行、橫行及垂直走行的骨骼肌纖維束組成比例不盡相同。13.5GD時(shí)舌體中央可見較多的星狀、紡錘狀細(xì)胞，舌肌未完全分化。正常組14.5GD時(shí)在靠近舌背面?zhèn)瓤梢姷胶藞A形的舌肌纖維橫斷面，舌體開始下降；在15.5GD時(shí)舌體繼續(xù)下降，雙側(cè)腭突水平相向生長；在16.5GD時(shí)舌降至口

7、底，舌發(fā)育基本完成。實(shí)驗(yàn)組與正常組發(fā)育過程相似，但部分個(gè)體發(fā)育延遲（圖12）。13.5GD時(shí)縱行肌占較大比例，14.5GD、15.5GD時(shí)垂直肌所占比例不斷增加。由13.5GD到14.5GD時(shí)，舌肌細(xì)胞由密集變得稀疏，14.5GD,15.5GD,16.5GD舌肌纖維密度幾乎無差別。但實(shí)驗(yàn)組HE染色切片中，胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)較多，染色淡，舌肌纖維粗大肥厚(圖34)。各時(shí)期bcl2陽性信號的表達(dá)無明顯變化。   2.2  舌體變化   13.5GD兩組胎鼠舌體厚，呈矢狀位生長；正常組14.5GD以后舌體變扁寬，而實(shí)驗(yàn)組則呈現(xiàn)不同程度的發(fā)育遲滯。實(shí)驗(yàn)組

8、與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組舌體高度明顯高于對照組。對照組中舌體高度隨孕期日的增加而逐漸降低，16.5GD時(shí)舌體已完全降至口底，與成年小鼠的舌體相似。實(shí)驗(yàn)組中舌體高度亦隨孕期日的增加而逐漸降低，13.5GD時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差別。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0軟件ANOVA方差分析,結(jié)果如表1。 2009年6月劉  賢等：舌發(fā)育異常與胎鼠地塞米松腭裂的關(guān)系表1  實(shí)驗(yàn)組和對照組陽性舌體高度比較 注：與對照組相比*P0.05，*P0.01             3 

9、; 討論   腭發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，遵循一定的規(guī)律，并呈現(xiàn)精密的時(shí)間空間關(guān)系，包括細(xì)胞的增殖、分化、凝聚等過程，同時(shí)受其它外界與內(nèi)部因素的影響。胚胎期腭突發(fā)育大致可分為五個(gè)時(shí)期：腭突發(fā)生期、垂直生長期、水平生長期、接觸融合期和分化成熟期。我們觀察到舌發(fā)育在一定程度上影響了腭的發(fā)育，參與了腭裂的形成。本實(shí)驗(yàn)中的13.5GD、14.5GD分別相當(dāng)于上述的腭發(fā)育的垂直生長期和水平生長期，兩個(gè)時(shí)期的過渡需要經(jīng)過腭的上抬，而腭的完全上抬變?yōu)樗较蛏L在一定程度上受舌體下降程度的影響。舌體的下降延遲或不完全下降，阻礙了雙側(cè)腭突水平方向的生長，以致不能在中線區(qū)融合，最終導(dǎo)致腭裂的產(chǎn)生。

10、我們發(fā)現(xiàn)13.5GD16.5GD對照組和實(shí)驗(yàn)組，舌體高度均逐漸下降；在13.5GD實(shí)驗(yàn)組和對照組中舌的高度無明顯差別，但在14.5GD16.5GD三個(gè)時(shí)期的對照組與實(shí)驗(yàn)組中，舌體高度具有顯著性差異（P0.05，P0.01）。實(shí)驗(yàn)組中舌體的下降相對延遲，導(dǎo)致舌體較高，影響腭的上抬及水平方向的生長，導(dǎo)致腭裂的產(chǎn)生。據(jù)此我們可以認(rèn)為舌體的下降延遲參與了腭裂的形成過程。   舌由表面的黏膜和深部的舌肌組成，舌肌由縱行、橫行及垂直的骨骼肌纖維束交織構(gòu)成，黏膜由復(fù)層扁平上皮與固有層組成。本實(shí)驗(yàn)中我們可以觀察到：在舌的不同生長發(fā)育時(shí)期舌的縱行、橫行及垂直的骨骼肌纖維束的組成比例是不全相同

11、的。從13.5GD16.5GD舌垂直肌的比例有所上升，13.5GD時(shí)舌肌縱行肌的比例最高。Takeshi Hirao等認(rèn)為大鼠在13GD時(shí)下頜突、側(cè)舌突不能明顯區(qū)分，舌前部有細(xì)胞聚集現(xiàn)象。在14GD時(shí)舌的基本形態(tài)形成，可區(qū)分出下頜突和舌。在15GD時(shí)下頜突完全形成，舌間充質(zhì)細(xì)胞變?yōu)樾菭睢⒓忓N狀并聚集于舌中央形成有規(guī)則的舌肌樣組織。在16GD時(shí)鼻和口腔被側(cè)腭突分開，舌體下降，間充質(zhì)分化為具有特殊排列形式的橫行、縱行、垂直舌肌，舌的形態(tài)類似于成年大鼠。在17GD時(shí)舌的上皮組織、舌肌組織、血管進(jìn)一步分化。在18GD19GD 時(shí)舌背面上皮迅速增生為56層，骨骼肌細(xì)胞增生。在20GD時(shí)上皮角質(zhì)化，肌周圍

12、血管發(fā)育成熟，舌的發(fā)育基本完成。大鼠發(fā)育的15 GD 相當(dāng)于小鼠的13.5GD 14GD，15.5GD相當(dāng)于14.5GD，16GD相當(dāng)于15GD，17GD18GD相當(dāng)于小鼠的16GD 16.5GD，本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到：小鼠在13.5GD時(shí)舌體中央可見較多的星狀、紡錘狀細(xì)胞；在14.5GD時(shí)在靠近舌背面?zhèn)瓤梢姷胶藞A形的舌肌細(xì)胞，舌體開始下降；在15.5GD時(shí)舌體繼續(xù)下降，雙側(cè)腭突水平相向生長；在16.5GD時(shí)舌降至口底，舌發(fā)育基本完成。這與Takeshi Hirao等 研究結(jié)果一致。另外，我們觀察到舌體的下降與舌體的高度和寬度有關(guān)，舌體體積比較大時(shí)舌的下降可能受到影響。組織切片染色后我們觀察發(fā)現(xiàn)

13、舌體骨骼肌肌束數(shù)量并未增多而是細(xì)胞漿、細(xì)胞外基質(zhì)增多，舌肌纖維粗大肥厚，但肌漿著色淺于對照組。這與Kobayashi等文獻(xiàn)報(bào)道一致。據(jù)此我們可認(rèn)為舌肌纖維粗大肥厚導(dǎo)致舌肌收縮無力，影響了舌體的下降，參與了腭裂的形成。我們又觀察到的bcl2陽性細(xì)胞數(shù)密度無明顯改變，也說明舌的下降延遲與肌纖維凋亡關(guān)系不大。因此我們認(rèn)為舌肌細(xì)胞的凋亡與增殖并未參與腭裂的形成過程。   綜上所述，舌體的發(fā)育異常在一定程度上影響了腭的發(fā)育，與腭突的發(fā)育異常共同導(dǎo)致了胎鼠腭裂的發(fā)生。【參考文獻(xiàn)】  1 劉賢,齊志麗,劉楊,等.地塞米松誘導(dǎo)小鼠腭裂動物模型的建立J.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,25(3):21242 田悅明,劉賢,劉楊,等.地塞米松對小鼠腭突細(xì)胞增殖和分布的影響J.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,25(4):13163 于世鳳.口腔組織病理學(xué)M.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，13:144 Takeshi H, Tsuyoshi S, Jingo K,et al.Angiogenesis and developmental expression of vascular endothelial growth factor in rat lingual papillaeJ.Kurlume Med