菠蘿蛋白酶的提取、分離純化及活性測(cè)定

1、15食安（1）班 李軍慶 201519030111 15食安（1）班 朱思俞 201522070130 15食安（1）班 張凱 201519030228菠蘿蛋白酶的提取、初步分離純化及活性測(cè)定15食安（1）班 張凱 摘要：本研究運(yùn)用硫酸銨沉淀法和透析法并結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G520染色法測(cè)定菠蘿皮中蛋白酶活性及蛋白質(zhì)含量，得到同一品種及成熟度的菠蘿皮經(jīng)兩種不同的純化方法處理，菠蘿皮中的蛋白酶都能被有效純化，但是蛋白酶活性會(huì)損失一部分。關(guān)鍵詞：菠蘿蛋白酶；透析法；分離純化；酶活性； 前 言菠蘿蛋白酶(bromelain)是從菠蘿植株中提取的一類(lèi)蛋白水解酶的總稱(chēng),主要存在于菠蘿莖和果實(shí)中,根據(jù)提取部位的

2、不同,分為莖菠蘿蛋白酶和果菠蘿蛋白酶。Marcano于1891年研究發(fā)現(xiàn)菠蘿汁中含有蛋白酶。隨后,人們對(duì)菠蘿蛋白酶展開(kāi)了一系列研究,發(fā)現(xiàn)其在醫(yī)藥和化工領(lǐng)域有很好的利用價(jià)值。1957年,Heineche等從菠蘿莖中提取得到蛋白質(zhì)水解酶,從而使菠蘿蛋白酶實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。目前,菠蘿蛋白酶的一些功能成分已得到成功分離,并應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。隨著提取純化技術(shù)的不斷進(jìn)步,高活性的菠蘿蛋白酶將廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和食品領(lǐng)域。1利用菠蘿皮分離純化菠蘿蛋白酶，不僅可充分利用資源，拓展菠蘿蛋白酶的獲取途徑和應(yīng)用空間，還可降低菠蘿加工廢料對(duì)環(huán)境的污染；隨著市場(chǎng)對(duì)菠蘿加工產(chǎn)品需求量的增大，對(duì)于菠蘿皮的研究與利用就顯得尤為

3、重要，尤其對(duì)最主要的功能成分蛋白酶的分離、純化與性質(zhì)的研究更有意義。2本文通過(guò)對(duì)菠蘿皮蛋白酶的提取，初步分離純化及活性測(cè)定進(jìn)行了初步研究，探討影響菠蘿蛋白酶活性的影響因素，并解決實(shí)驗(yàn)存在的一些問(wèn)題。1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器11實(shí)驗(yàn)材料與試劑新鮮菠蘿，透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量8 00014 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸緩沖液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸緩沖液配制（PBS），1酪蛋白，激活劑含20mmo1L半胱氨酸-鹽酸鹽、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二鈉)，10三氯乙酸(TCA)。12 實(shí)驗(yàn)儀器722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有

4、限公司；752型光柵分光光度計(jì)：北京光學(xué)儀器廠；TDL-60B臺(tái)式離心機(jī)：上海安寧科學(xué)儀器廠；D5M離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；可控硅恒溫水浴鍋：上海錦屏儀器儀表有限公司；AMPUT電子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京賽多利斯天平有限公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；HZS-H型水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1菠蘿蛋白酶的粗酶提取稱(chēng)取菠蘿皮材料20g，將菠蘿皮在清水中洗凈，瀝干，切成小段后置于超高速攪拌機(jī)中，加入約60mL預(yù)冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，

5、持續(xù)攪拌1015min至粉碎，攪拌完成后用4層紗布過(guò)濾，得到濾液后，用冷凍離心機(jī)于4°C 3000rpm離心6min，棄沉淀，即得到菠蘿蛋白酶粗提液，測(cè)定粗提液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。2.2鹽析 -，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液最終硫酸銨飽和度為30%，放置于冰水混合物（4）30min 后，酶蛋白沉淀析出，4°C 4000rpm離心10min，收集沉淀， 加入0.1mo1/L pH 7.8 PBS約15mL至完全溶解，測(cè)定其體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。2.3透析 將溶解液裝入2.5 cm×8cm透析袋（預(yù)先將透析袋在蒸餾

6、水中煮沸30min）中，于 500mL 燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下用蒸餾水透析，15min換水一次，換水34次后，檢查SO42-是否已被除凈（檢查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支試管，滴加23滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示SO42- 未除凈，若無(wú)沉淀出現(xiàn)，表示透析完全）。若透析液有沉淀，將透析液用濾紙過(guò)濾，測(cè)定過(guò)濾液的體積、蛋白質(zhì)含量和酶活性。2.4酶活力測(cè)定方法取2支試管，設(shè)置一支為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，三支為平行樣品。取0.1mL酶液，加入0.9mL激活劑，加入37預(yù)熱的1%酪蛋白溶液1mL，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入10%三氯乙酸3mL反應(yīng)終止酶反應(yīng)。對(duì)照管先加入10%三氯乙酸溶液，

7、后加酪蛋白溶液，其它與測(cè)定管相同。離心（3000r/min，5min）或過(guò)濾，清液于280nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。酶活單位定義：在上述條件下 ，每10min增加0.001個(gè)光吸收值為1個(gè)酶單位（U）。實(shí)驗(yàn)步驟按照表格中完成。表1 酶活測(cè)定步驟試劑(ml)對(duì)照組平行樣品1平行樣品2平行樣品3TCA3酶液0.10.10.10.1激活劑0.90.90.90.9酪蛋白111137°C準(zhǔn)確反應(yīng)10minTCA333A280nm OD值粗提0.7910.8180.868鹽析0.8230.9070.986透析0.8940.8750.8482.5蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法將酶液稀釋至一定程度，采用考馬斯亮蘭

8、G-250法測(cè)定溶液中可溶性蛋白的含量（參照附錄1）。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1 蛋白質(zhì)含量計(jì)算3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表X 0-1000ug/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制管號(hào)1234561000g/mL牛血清白蛋白00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.80.60.40.20蛋白質(zhì)濃度（g/mL）0200406008001000吸光值（A595）00.1570.2450.3910.5350.656得到從1到6號(hào)管的牛血清白蛋白溶液濃度分別為0、200、400、600、800、1000g/mL，準(zhǔn)確吸取各管溶液0.lmL，加入5ml考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，靜置2min，測(cè)定595nm吸光值，繪

9、制0-1000g/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1 蛋白吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線3.1.2樣品的測(cè)定準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.1mL放入具塞刻度試管中，與步驟（1）操作相同，測(cè)得樣品的光吸收值A(chǔ)595nm。3.1.3結(jié)果計(jì)算由標(biāo)準(zhǔn)曲線可查出相應(yīng)的蛋白濃度（g/mL），可按如下公式計(jì)算出樣品中蛋白含量。 查出的蛋白提取液濃度（g/mL）×定容體積(mL)樣品蛋白含量(gg鮮重) 樣品重量(g)樣品蛋白質(zhì)含量（粗提純）=（517.7×62）/20.00=1604.9（µg/g）樣品蛋白質(zhì)含量（鹽析）=（706×16）/20.00=564.8（µg/g）樣品蛋白質(zhì)含量（透析）=（

10、1017.7×13）/20.00=661.5（µg/g）3.2酶活力計(jì)算最后酶活結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。 A280nm0.001×0.1×0.1酶液活力（U/mL）= ×稀釋倍數(shù)步驟空白平行1平行2平行3平均值A(chǔ)280nm OD值粗提0.7910.8180.8680.826鹽析0.8230.9070.9860.905透析0.8940.8750.8480.872粗酶液活力（U/mL）=A280nm×稀釋倍數(shù)0.001×0.1= 0.856×10.001×0.1 =8257 U/mL鹽析酶液活力（U/mL

11、）=A280nm×稀釋倍數(shù)0.001×0.1= 0.905×10.001×0.1 =9053 U/mL透析酶液活力（U/mL）=A280nm×稀釋倍數(shù)0.001×0.1= 0.872×10.001×0.1 =8723 U/mL3.3酶比活的計(jì)算酶比活（U/mg· 蛋白）=酶活力/酶蛋白質(zhì)含量粗酶比活（U/mg 蛋白）= 酶活力酶蛋白質(zhì)含量=82561.6049=5141.8（U/mg 蛋白）鹽析酶比活（U/mg 蛋白）=酶活力酶蛋白質(zhì)含量= 90530.5648= 16029.3（U/mg 蛋白）透析酶比

12、活（U/mg 蛋白）=酶活力酶蛋白質(zhì)含量= 87230.6615=13183.2（U/mg 蛋白）3.4酶純化過(guò)程中回收率計(jì)算回收率（%）=（純化酶總活力/粗酶液總活力）×100= （純化酶活力×純化酶液體積）/（粗酶活力×粗酶體積）×100鹽析回收率（%）=（9053×16.0）/（8256×62.0）=28.30%透析回收率（%）=（8723×13.0）/（8256×62.0）=22.15%3.5酶純化倍數(shù)的計(jì)算純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力鹽析純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力=16029.3/5141.

13、8 =3.12透析純化倍數(shù)=純化酶比活力/粗酶比活力=13183.2/5141.8 =2.563.6分析及討論將測(cè)定的數(shù)據(jù)整理計(jì)算分別填入下表，并菠蘿蛋白酶的分離純化效果進(jìn)行分析和討論。表X 菠蘿蛋白酶分離純化表步驟總體積（mL）總蛋白質(zhì)含量（mg）總活力（U/mL）比活力（U/mg蛋白）回收率（%）純化倍數(shù)粗提6232.12 8256.67 5141.78 -鹽析1611.30 9053.33 16029.27 28.30 3.12 透析1313.23 8723.33 13183.21 22.15 2.56 圖x 菠蘿蛋白酶活對(duì)比圖4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論與討論本次實(shí)驗(yàn)菠蘿蛋白酶經(jīng)過(guò)了粗提純、鹽析及透析

14、三個(gè)步驟的分離純化，結(jié)果得到粗提純的蛋白質(zhì)濃度最高，透析后蛋白質(zhì)濃度最高，鹽析次之；理論上，粗酶蛋白濃度應(yīng)該比偷襲鹽析低。原因可是鹽析和偷襲操作不當(dāng)導(dǎo)致菠蘿蛋白酶損失嚴(yán)重，或者鹽析后的沉淀無(wú)法完全溶解也可能導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)含量降低。鹽析以及透析后菠蘿蛋白酶的活力比粗酶高，這可能是因?yàn)槲贷}析透析之前，菠蘿蛋白酶受例如金屬離子等因素影響，導(dǎo)致蹙眉的酶活力和酶比活比鹽析和透析低。由菠蘿蛋白酶分離純化表可知，鹽析和透析得到的酶回收率都不高?？赡苁菍?shí)驗(yàn)中加入的硫酸銨并沒(méi)有充分溶解，導(dǎo)致局部硫酸銨含量過(guò)高，使得蛋白酶變性失活，最終影響蛋白酶的回收率。在純化倍數(shù)上，鹽析的純化倍數(shù)比透析的純化倍數(shù)要高一些，這

15、是與兩個(gè)處理環(huán)節(jié)得到酶活力及蛋白質(zhì)含量有關(guān)，鹽析后酶的濃度比透析的高，所以鹽析的純化倍數(shù)會(huì)更高?！舅伎碱}】1.如何防止酶在分離純化過(guò)程中發(fā)生變性失活？酶的變性失活主要與有機(jī)溶劑、金屬離子、高溫、高酸堿等因素有關(guān)。所以在分離純化時(shí)注意：不能用自來(lái)水配制透析液；不使用不清潔的儀器設(shè)備；控制反應(yīng)溫度，避免高溫。2.常見(jiàn)的酶活性表示方法有那些（如：U/mL酶液；U/mg蛋白質(zhì); U/g干重或鮮重；U/g 酶粉 等）？它們各有什么含義，適用哪些場(chǎng)合？U/mL酶液用來(lái)表示每單位體積酶液中的酶活力情況，適用于表示液體酶中的酶活力大小。U/mg蛋白質(zhì)用來(lái)表示單位質(zhì)量樣品中的酶活力情況，適用于表示含一種或多種蛋

16、白的樣品中的酶活力大小。U/g干重或鮮重用來(lái)表示每克原始樣品中的酶活力情況，適用于原始樣品的酶活力表示。U/g 酶粉表示每克酶粉中的酶活力情況，適用于酶制劑的酶活力測(cè)定或者酶制劑的相應(yīng)濃度配制。3.蛋白質(zhì)的沉淀作用還有哪些方法？哪些變性了？哪些沒(méi)有變性？ 沉淀蛋白質(zhì)常用的方法：?jiǎn)螌幊恋矸?、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑法、重金屬法、生物堿試劑法。其中有機(jī)溶劑法、單寧沉淀法、重金屬法、生物堿法往往會(huì)使蛋白質(zhì)變性，等電點(diǎn)沉淀法通常不會(huì)使蛋白質(zhì)變性。4.實(shí)驗(yàn)中硫酸銨鹽析為什么要選擇0%30%飽和度？在0-30%的飽和度范圍內(nèi)，菠蘿蛋白酶的酶回收率隨著飽和度的增大而增大，當(dāng)超出這個(gè)范圍時(shí)菠蘿蛋白酶的回收率降低。因此，本次實(shí)驗(yàn)選擇在蓋飽和度范圍內(nèi)進(jìn)行鹽析處理。3參 考 文 獻(xiàn)1吳茂玉,馬超,喬旭光,宋燁,趙巖.菠蘿蛋白酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展J.食品科技,2008(08):17-20.2陳偉杰. 菠蘿皮蛋白酶的制備、特性及應(yīng)用的研究D. 錦州醫(yī)科大