酶學(xué)分析技術(shù)

1、n本章內(nèi)容概要：本章內(nèi)容概要：第一節(jié)第一節(jié) 酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶活性測(cè)定的基本知識(shí) 第二節(jié)第二節(jié) 酶活性測(cè)定方法及酶學(xué)分析的類(lèi)型酶活性測(cè)定方法及酶學(xué)分析的類(lèi)型第三節(jié)第三節(jié) 同工酶測(cè)定同工酶測(cè)定第四節(jié)第四節(jié) 酶學(xué)分析在臨床診斷上的應(yīng)用酶學(xué)分析在臨床診斷上的應(yīng)用第五節(jié)第五節(jié) 酶活性測(cè)定最適條件的選擇酶活性測(cè)定最適條件的選擇1 1、掌握掌握酶活性的國(guó)際單位定義，酶活性濃度的表示方法及酶活性單位酶活性的國(guó)際單位定義，酶活性濃度的表示方法及酶活性單位的計(jì)算公式；酶活性測(cè)定的連續(xù)監(jiān)測(cè)法和定時(shí)法的概念、區(qū)別和結(jié)果的計(jì)算公式；酶活性測(cè)定的連續(xù)監(jiān)測(cè)法和定時(shí)法的概念、區(qū)別和結(jié)果的計(jì)算方法；酶偶聯(lián)反應(yīng)的在酶活性測(cè)

2、定和酶法分析代謝物中的應(yīng)用；的計(jì)算方法；酶偶聯(lián)反應(yīng)的在酶活性測(cè)定和酶法分析代謝物中的應(yīng)用；以以NADNAD（P P）H H為指示系統(tǒng)和色素原底物在酶活性測(cè)定中的應(yīng)用為指示系統(tǒng)和色素原底物在酶活性測(cè)定中的應(yīng)用. .n本章教學(xué)要求：本章教學(xué)要求：2 2、熟悉熟悉酶促反應(yīng)進(jìn)程；酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)；酶學(xué)分析在臨床診斷上酶促反應(yīng)進(jìn)程；酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)；酶學(xué)分析在臨床診斷上的應(yīng)用。的應(yīng)用。3 3、了解了解KmKm值、值、VmaxVmax值的應(yīng)用及值的應(yīng)用及KmKm和和VmaxVmax的測(cè)定；同工酶測(cè)定和酶活性的測(cè)定；同工酶測(cè)定和酶活性測(cè)定最適條件的選擇。測(cè)定最適條件的選擇。第一節(jié)第一節(jié) 酶活性測(cè)定的基本

3、知識(shí)酶活性測(cè)定的基本知識(shí) n酶活性的概念酶活性的概念 n酶活性單位酶活性單位 n酶活性單位的計(jì)算酶活性單位的計(jì)算 n酶促反應(yīng)進(jìn)程酶促反應(yīng)進(jìn)程 n酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué) 一、酶活性的概念一、酶活性的概念 酶活性酶活性即酶促反應(yīng)速度，指在規(guī)定條件下單位時(shí)即酶促反應(yīng)速度，指在規(guī)定條件下單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量。 底物濃度為底物濃度為S S, ,產(chǎn)物濃度為產(chǎn)物濃度為P P, ,時(shí)間為時(shí)間為t t，反應(yīng)速度為，反應(yīng)速度為v vv =-dS/dt 或或 v =dP/dt。注：在實(shí)際測(cè)定酶促反應(yīng)速度時(shí)，以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的注：在實(shí)際測(cè)定酶促反應(yīng)速度

4、時(shí)，以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為好。生成量為好。 二、酶活性單位二、酶活性單位n定義：定義：指在一定條件下使酶促反應(yīng)達(dá)到某一速度指在一定條件下使酶促反應(yīng)達(dá)到某一速度時(shí)所需要的酶量。酶活性單位是一個(gè)人為規(guī)定的標(biāo)時(shí)所需要的酶量。酶活性單位是一個(gè)人為規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)。慣用單位慣用單位：酶活性測(cè)定方法的建立者所規(guī)定的單位。酶活性測(cè)定方法的建立者所規(guī)定的單位。國(guó)際單位國(guó)際單位 ：1IU指在規(guī)定條件（最適指在規(guī)定條件（最適pH，最適底物濃度）下，最適底物濃度）下，每分鐘轉(zhuǎn)化每分鐘轉(zhuǎn)化1 mol底物的酶量。單位為底物的酶量。單位為IU/L 。Katal單位單位：1Katal指在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化指在規(guī)定

5、條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的底物的酶量，酶量，1Katal=60106IU。三、酶活性單位的計(jì)算三、酶活性單位的計(jì)算n步驟：步驟：運(yùn)用公式進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用公式進(jìn)行計(jì)算。明確測(cè)定方法的明確測(cè)定方法的酶單位定義酶單位定義，按照酶單位，按照酶單位定義確定物質(zhì)量、體積和時(shí)間的單位，定義確定物質(zhì)量、體積和時(shí)間的單位，n計(jì)算公式計(jì)算公式: 產(chǎn)物的增加量產(chǎn)物的增加量 每單位規(guī)定的保溫時(shí)間每單位規(guī)定的保溫時(shí)間 10001000（mlml）酶單位酶單位/ /升升 = = 每單位規(guī)定的產(chǎn)物增加量每單位規(guī)定的產(chǎn)物增加量 實(shí)際保溫時(shí)間實(shí)際保溫時(shí)間 實(shí)際標(biāo)本用量（實(shí)際標(biāo)本用量（mlml）分光光度法測(cè)定的公式：分光光度

6、法測(cè)定的公式： （A A測(cè)定測(cè)定 A A對(duì)照）對(duì)照）VV總總10106 6 每單位規(guī)定的保溫時(shí)每單位規(guī)定的保溫時(shí)間間酶單位酶單位/ /升升 = = LVLV標(biāo)標(biāo) 實(shí)際保溫時(shí)間實(shí)際保溫時(shí)間四、酶促反應(yīng)進(jìn)程四、酶促反應(yīng)進(jìn)程n 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線 n酶量的測(cè)定：酶量的測(cè)定： 通過(guò)酶活性測(cè)定間接測(cè)得酶的含量，因此，要準(zhǔn)通過(guò)酶活性測(cè)定間接測(cè)得酶的含量，因此，要準(zhǔn)確測(cè)定酶量，應(yīng)使酶濃度（確測(cè)定酶量，應(yīng)使酶濃度（E E）與酶促反應(yīng)速度）與酶促反應(yīng)速度成正比，即成正比，即E E-d-dS S/dt/dt或或E EddP P/dt/dt。能夠真正代表酶活性大小的是線性期的酶促反應(yīng)速能夠真正代表酶活

7、性大小的是線性期的酶促反應(yīng)速度，即酶促反應(yīng)初速度。度，即酶促反應(yīng)初速度。 酶活性測(cè)定時(shí)首先要確定線性期，在此期測(cè)定反酶活性測(cè)定時(shí)首先要確定線性期，在此期測(cè)定反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確代表酶活性。應(yīng)速度才能準(zhǔn)確代表酶活性。酶的含量酶的含量 酶活性酶活性酶促反應(yīng)初速度酶促反應(yīng)初速度五、酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)五、酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)n中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)：中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)： 酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，酶首先與底物結(jié)合為中間產(chǎn)物，然后再催酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，酶首先與底物結(jié)合為中間產(chǎn)物，然后再催化底物反應(yīng)生成產(chǎn)物。化底物反應(yīng)生成產(chǎn)物。E + S ES E + P n米米- -曼氏方程：曼氏方程： VmaxSv = S+ Km 上式中上式中v v

8、代表反應(yīng)速度，代表反應(yīng)速度，VmaxVmax代表最大反應(yīng)速度，代表最大反應(yīng)速度，S S代表底物濃度，代表底物濃度，KmKm稱(chēng)為米氏常數(shù)。稱(chēng)為米氏常數(shù)。（一）米氏常數(shù)的定義（一）米氏常數(shù)的定義由米由米- -曼氏方程可以導(dǎo)出：曼氏方程可以導(dǎo)出： （Vmax-v）SKm = v 當(dāng)當(dāng)v = 1/2Vmaxv = 1/2Vmax時(shí)，時(shí)，Km =Km =S S。因此。因此KmKm值為反應(yīng)速度相當(dāng)于值為反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。KmKm值是酶的特征常數(shù)值是酶的特征常數(shù)，具有重，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。要的應(yīng)用價(jià)值。（二）（二）Km值的應(yīng)用值的應(yīng)用1.鑒定酶的種類(lèi)

9、鑒定酶的種類(lèi) Km值是酶的特征常數(shù)，在反應(yīng)條件一定時(shí)，只與值是酶的特征常數(shù)，在反應(yīng)條件一定時(shí)，只與酶的種類(lèi)和底物的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。酶的種類(lèi)和底物的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無(wú)關(guān)。不同種不同種類(lèi)的酶其類(lèi)的酶其Km值不同，對(duì)于一種未知的酶，可在規(guī)定的值不同，對(duì)于一種未知的酶，可在規(guī)定的條件下測(cè)定其條件下測(cè)定其Km值加以鑒定。值加以鑒定。 表表7-1 7-1 某些酶的某些酶的KmKm值值 酶酶 底物底物 Km(mmol/L)乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 丙酮酸丙酮酸 0.017己糖激酶己糖激酶 D-葡萄糖葡萄糖 0.05 D-果糖果糖 1.5 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 D-乳糖乳糖 4.0碳酸酐酶碳酸酐酶

10、 H2CO3 9.0過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶 H2O2 25蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖蔗糖 28糜蛋白酶糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸甘氨酰酪氨酰甘氨酸 1082.2.反映酶與底物的親合力反映酶與底物的親合力 KmKm值越大，酶與底物親合力越小，值越大，酶與底物親合力越小，KmKm值越小，酶與底物親合力越大。值越小，酶與底物親合力越大。 3.3.選擇酶的最適底物選擇酶的最適底物 KmKm值取決于酶的種類(lèi)和底物的性質(zhì)，在酶一定時(shí)，不同底值取決于酶的種類(lèi)和底物的性質(zhì)，在酶一定時(shí)，不同底物有不同的物有不同的KmKm值。酶活力測(cè)定時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇酶的最適底物，值。酶活力測(cè)定時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇酶的最適底物，使酶促反應(yīng)容易進(jìn)

11、行，并節(jié)省底物用量。使酶促反應(yīng)容易進(jìn)行，并節(jié)省底物用量。 4.4.計(jì)算不同底物濃度時(shí)酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最計(jì)算不同底物濃度時(shí)酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的比率大反應(yīng)速度的比率 根據(jù)米根據(jù)米- -曼氏方程可以計(jì)算曼氏方程可以計(jì)算 5.5.設(shè)計(jì)適宜的底物濃度設(shè)計(jì)適宜的底物濃度 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線表明，只有初速度才能真正代表酶酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線表明，只有初速度才能真正代表酶活性，一般要求初速度達(dá)到最大速度的活性，一般要求初速度達(dá)到最大速度的90%90%95%95%、底物、底物消耗率為消耗率為1%1%5%5%。這樣既可以近似地表示酶活性，又不。這樣既可以近似地表示酶活性，又不致于使底物濃度過(guò)高而造成浪費(fèi)。

12、致于使底物濃度過(guò)高而造成浪費(fèi)。 (三三)Vmax的應(yīng)用的應(yīng)用n定義定義 ： Vmax指指酶完全被底物分子飽和時(shí)的反應(yīng)速度。酶完全被底物分子飽和時(shí)的反應(yīng)速度。 n應(yīng)用：應(yīng)用： Vmax可用來(lái)計(jì)算酶的轉(zhuǎn)化率（可用來(lái)計(jì)算酶的轉(zhuǎn)化率（TN），即單位時(shí)間內(nèi)每分子），即單位時(shí)間內(nèi)每分子酶可使底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的分子數(shù)，單位為分子數(shù)酶可使底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的分子數(shù)，單位為分子數(shù)/秒。當(dāng)反秒。當(dāng)反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度時(shí)，如果已知酶量，則可計(jì)算出酶的應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度時(shí)，如果已知酶量，則可計(jì)算出酶的轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率： TN =底物轉(zhuǎn)化量（底物轉(zhuǎn)化量（mol/s）/酶量（酶量（mol） (四四)Km和和Vmax的

13、測(cè)定的測(cè)定1Linweaver-Burk作圖法作圖法,又稱(chēng)為雙倒數(shù)作圖法又稱(chēng)為雙倒數(shù)作圖法 1 Km +S Km 1 1 = = + v VmaxS Vmax S Vmax2Cornish-Bowden作圖法作圖法 又稱(chēng)為直線線性作圖法。又稱(chēng)為直線線性作圖法。 第二節(jié)第二節(jié) 酶活性測(cè)定方法及酶學(xué)分析的類(lèi)型酶活性測(cè)定方法及酶學(xué)分析的類(lèi)型n酶活性的測(cè)定方法酶活性的測(cè)定方法n工具酶工具酶n酶偶聯(lián)測(cè)定法酶偶聯(lián)測(cè)定法n底物濃度測(cè)定底物濃度測(cè)定一、酶活性的測(cè)定方法一、酶活性的測(cè)定方法按照按照對(duì)酶對(duì)酶促反應(yīng)時(shí)促反應(yīng)時(shí)間的選擇間的選擇不同不同 連續(xù)監(jiān)測(cè)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法 固定時(shí)間法固定時(shí)間法（一）固定時(shí)間法（一）固

14、定時(shí)間法n分類(lèi)：分類(lèi)： 終點(diǎn)法：在反應(yīng)進(jìn)行到預(yù)定時(shí)間后要終止反應(yīng)。終點(diǎn)法：在反應(yīng)進(jìn)行到預(yù)定時(shí)間后要終止反應(yīng)。 兩點(diǎn)法：該方法反應(yīng)時(shí)間的預(yù)定是從兩點(diǎn)法：該方法反應(yīng)時(shí)間的預(yù)定是從t t1 1t t2 2 。n定義：定義：測(cè)定酶促反應(yīng)開(kāi)始后一段時(shí)間內(nèi)底物的減少量測(cè)定酶促反應(yīng)開(kāi)始后一段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。或產(chǎn)物的增加量。 n特點(diǎn)：特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單是簡(jiǎn)單。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)是難以確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。是難以確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。 n注意：注意：固定時(shí)間法時(shí)間段的預(yù)定不宜太長(zhǎng)，一般以固定時(shí)間法時(shí)間段的預(yù)定不宜太長(zhǎng)，一般以30306060分分鐘為宜。鐘為宜。 （二

15、）連續(xù)監(jiān)測(cè)法（二）連續(xù)監(jiān)測(cè)法n原理：原理：n定義：定義：測(cè)定底物或產(chǎn)物隨時(shí)間的變化量，又稱(chēng)為速率法。測(cè)定底物或產(chǎn)物隨時(shí)間的變化量，又稱(chēng)為速率法。 該方法每隔一定時(shí)間（該方法每隔一定時(shí)間（10s10s60s60s）測(cè)定一次底物或產(chǎn)）測(cè)定一次底物或產(chǎn)物的變化量，連續(xù)測(cè)定多點(diǎn)，然后將測(cè)定結(jié)果對(duì)時(shí)間作圖物的變化量，連續(xù)測(cè)定多點(diǎn)，然后將測(cè)定結(jié)果對(duì)時(shí)間作圖，繪制反應(yīng)速度曲線。，繪制反應(yīng)速度曲線。 n特點(diǎn)：特點(diǎn)： 在方法設(shè)計(jì)上，選擇紫外吸收法或色原顯色法在方法設(shè)計(jì)上，選擇紫外吸收法或色原顯色法 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 要求高，要求能夠精確地控制溫度、要求高，要求能夠精確地控制溫度、pHpH值和底物濃度等反值和底物濃度

16、等反應(yīng)條件，要求儀器具有恒溫裝置及自動(dòng)監(jiān)測(cè)功能，半自動(dòng)及自應(yīng)條件，要求儀器具有恒溫裝置及自動(dòng)監(jiān)測(cè)功能，半自動(dòng)及自動(dòng)生化分析儀都能達(dá)到這些要求。動(dòng)生化分析儀都能達(dá)到這些要求。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : 能動(dòng)態(tài)觀測(cè)酶促反應(yīng)進(jìn)程，可以明顯地找到反應(yīng)的線性期，能動(dòng)態(tài)觀測(cè)酶促反應(yīng)進(jìn)程，可以明顯地找到反應(yīng)的線性期，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在較短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定。結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在較短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定。 二、工具酶二、工具酶n定義：定義：偶聯(lián)：偶聯(lián)：工具酶與待測(cè)酶、工具酶與工具酶之間的聯(lián)合。工具酶與待測(cè)酶、工具酶與工具酶之間的聯(lián)合。 工具酶：工具酶：將作為試劑用于測(cè)定待測(cè)酶活性或底物濃度的酶。將

17、作為試劑用于測(cè)定待測(cè)酶活性或底物濃度的酶。工具酶有工具酶有氧化還原酶類(lèi)、轉(zhuǎn)移酶類(lèi)和水解酶類(lèi)氧化還原酶類(lèi)、轉(zhuǎn)移酶類(lèi)和水解酶類(lèi)n分類(lèi)：分類(lèi)：表表7-2 7-2 常用工具酶的名稱(chēng)及其縮寫(xiě)符號(hào)常用工具酶的名稱(chēng)及其縮寫(xiě)符號(hào) 名名 稱(chēng)稱(chēng) 縮寫(xiě)符號(hào)縮寫(xiě)符號(hào) 名名 稱(chēng)稱(chēng) 縮寫(xiě)符號(hào)縮寫(xiě)符號(hào)乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 LDH蘋(píng)果酸脫氫酶蘋(píng)果酸脫氫酶 MDH6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶 G6PD谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶 GLDH葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 GOD膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶 COD磷酸甘油氧化酶磷酸甘油氧化酶 GPO過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶 POD己糖激酶己糖激酶 HK肌酸激酶肌酸激酶 CK丙酮酸激酶丙酮酸

18、激酶 PK甘油激酶甘油激酶 GK脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶 LPL膽固醇酯酶膽固醇酯酶 CE脲酶脲酶肌酐酶肌酐酶三、酶偶聯(lián)測(cè)定法三、酶偶聯(lián)測(cè)定法n應(yīng)用應(yīng)用：對(duì)于底物或產(chǎn)物不能直接測(cè)定或難于準(zhǔn)確測(cè)：對(duì)于底物或產(chǎn)物不能直接測(cè)定或難于準(zhǔn)確測(cè)定的酶促反應(yīng)定的酶促反應(yīng) 。 Ex Ea EiA B C P 式中式中A A為底物，為底物，B B、C C為中間產(chǎn)物，為中間產(chǎn)物，P P為產(chǎn)物（必須能夠直接測(cè)為產(chǎn)物（必須能夠直接測(cè)定），定），ExEx為待測(cè)酶，為待測(cè)酶，EaEa、EiEi都為工具酶。按照工具酶作用的不同，都為工具酶。按照工具酶作用的不同，EaEa又稱(chēng)為輔助酶，又稱(chēng)為輔助酶，EiEi又稱(chēng)為指示酶，又稱(chēng)

19、為指示酶，C PC P稱(chēng)為指示反應(yīng)。稱(chēng)為指示反應(yīng)。（一）酶偶聯(lián)反應(yīng)的原理（一）酶偶聯(lián)反應(yīng)的原理 在應(yīng)用酶偶聯(lián)法測(cè)定時(shí)，關(guān)鍵在于確定恒態(tài)期，因?yàn)橹挥性趹?yīng)用酶偶聯(lián)法測(cè)定時(shí)，關(guān)鍵在于確定恒態(tài)期，因?yàn)橹挥泻銘B(tài)期才能代表酶活性。如酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)所述，恒態(tài)期恒態(tài)期才能代表酶活性。如酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)所述，恒態(tài)期可以通過(guò)測(cè)定指示酶的可以通過(guò)測(cè)定指示酶的KmKm和和VmaxVmax等動(dòng)力學(xué)因數(shù)加以計(jì)算確定。等動(dòng)力學(xué)因數(shù)加以計(jì)算確定。（二）常用指示酶及其指示反應(yīng)（二）常用指示酶及其指示反應(yīng)1 1脫氫酶脫氫酶 用作工具酶的脫氫酶都是以用作工具酶的脫氫酶都是以NAD(P)H為輔酶的脫為輔酶的脫氫酶，例如氫酶，例

20、如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它們催等，它們催化下列反應(yīng)：化下列反應(yīng)： P + NAD(P)H + H+ PH2 + NAD(P)+可對(duì)可對(duì)NAD(P)HNAD(P)H在紫外吸收或紫外激發(fā)熒光進(jìn)行測(cè)定在紫外吸收或紫外激發(fā)熒光進(jìn)行測(cè)定 n應(yīng)用：應(yīng)用：ALT、AST、CK等酶活性測(cè)定。等酶活性測(cè)定。2 2過(guò)氧化物酶過(guò)氧化物酶 PODPOD可可催化過(guò)氧化氫與某些色原反應(yīng)，例如與催化過(guò)氧化氫與某些色原反應(yīng)，例如與4-氨氨基安替比林（基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，將其氧化為有色物）和酚反應(yīng)，將其氧化為有色物質(zhì)，反應(yīng)如下：質(zhì)，反應(yīng)如下： POD 2H2O2 + 4-AAP + 酚酚 醌亞胺（

21、紅色）醌亞胺（紅色） + 4H2OTrinder反應(yīng)反應(yīng)： n應(yīng)用應(yīng)用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（屬于氧化酶、甘油氧化酶、尿酸酶（屬于氧化酶類(lèi)）等都可以將各自的底物氧化為過(guò)氧化氫，因此都可以與類(lèi)）等都可以將各自的底物氧化為過(guò)氧化氫，因此都可以與POD偶偶聯(lián)，通過(guò)聯(lián)，通過(guò)Trinder反應(yīng)加以測(cè)定。反應(yīng)加以測(cè)定。四、底物濃度測(cè)定四、底物濃度測(cè)定 利用酶催化反應(yīng)的高效率和專(zhuān)一性，可以測(cè)利用酶催化反應(yīng)的高效率和專(zhuān)一性，可以測(cè)定底物濃度。與酶活性測(cè)定類(lèi)似。定底物濃度。與酶活性測(cè)定類(lèi)似。 第三節(jié)第三節(jié) 同工酶測(cè)定同工酶測(cè)定n同工酶的定義同工酶的定義n同工酶產(chǎn)生的機(jī)理同工酶產(chǎn)生的機(jī)理n同

22、工酶的測(cè)定方法同工酶的測(cè)定方法n同工酶的定義同工酶的定義 是催化功能相同，但是分子組成及理化性質(zhì)不同是催化功能相同，但是分子組成及理化性質(zhì)不同的一組酶，是在同一種屬中由不同基因位點(diǎn)或等位的一組酶，是在同一種屬中由不同基因位點(diǎn)或等位基因編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜多體?；蚓幋a的多肽鏈單體、純聚體或雜多體。 一、同工酶產(chǎn)生的機(jī)理一、同工酶產(chǎn)生的機(jī)理（一）由不同基因位點(diǎn)編碼（一）由不同基因位點(diǎn)編碼（二）由等位基因編碼（二）由等位基因編碼（三）由多肽鏈化學(xué)修飾產(chǎn)生（三）由多肽鏈化學(xué)修飾產(chǎn)生二、同工酶的測(cè)定方法二、同工酶的測(cè)定方法（一）按照理化性質(zhì)不同進(jìn)行分離鑒定（一）按照理化性質(zhì)不同進(jìn)行分離鑒定1

23、1電泳法電泳法 同工酶氨基酸組成不同，等電點(diǎn)不同，電泳遷移率同工酶氨基酸組成不同，等電點(diǎn)不同，電泳遷移率也就不同，據(jù)此可用電泳法分離鑒定。也就不同，據(jù)此可用電泳法分離鑒定。 2 2層析法層析法 根據(jù)同工酶分子荷電量不同，可用離子交換層析法根據(jù)同工酶分子荷電量不同，可用離子交換層析法加以分離。加以分離。（二）按照底物專(zhuān)一性不同進(jìn)行鑒定（二）按照底物專(zhuān)一性不同進(jìn)行鑒定 同工酶同工酶底物專(zhuān)一性不同，底物專(zhuān)一性不同，Km值也不同。如果同工值也不同。如果同工酶之間的酶之間的Km值差別足夠大，可以通過(guò)測(cè)定其值差別足夠大，可以通過(guò)測(cè)定其Km值加值加以鑒定。以鑒定。 （三）按照（三）按照最適最適pH不同進(jìn)行鑒

24、定不同進(jìn)行鑒定 同工酶同工酶分子氨基酸組成不同，最適分子氨基酸組成不同，最適pH也不同。如也不同。如果同工酶最適果同工酶最適pH之間的差別足夠大，可以通過(guò)調(diào)節(jié)緩之間的差別足夠大，可以通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖溶液的沖溶液的pH值加以鑒定。值加以鑒定。 （四）按照免疫學(xué)特性不同進(jìn)行分離鑒定（四）按照免疫學(xué)特性不同進(jìn)行分離鑒定（五）按照耐熱程度不同進(jìn)行鑒定（五）按照耐熱程度不同進(jìn)行鑒定（六）選擇性抑制法（六）選擇性抑制法第四節(jié)第四節(jié) 酶學(xué)分析在臨床診斷上的應(yīng)用酶學(xué)分析在臨床診斷上的應(yīng)用n血漿酶的來(lái)源血漿酶的來(lái)源n酶的區(qū)域化分布酶的區(qū)域化分布n酶活性測(cè)定在臨床診斷中的應(yīng)用酶活性測(cè)定在臨床診斷中的應(yīng)用n同工酶的診斷價(jià)值同工酶的診斷價(jià)值一、血漿酶的來(lái)源一、血漿酶的來(lái)源血漿酶血漿酶 血漿特異酶血漿特異酶 非血漿特異酶非血漿特異酶 外分泌酶外分泌酶 細(xì)胞內(nèi)酶細(xì)胞內(nèi)酶 二、酶的區(qū)域化分布二、酶的區(qū)域化分布表表7-3 7-3 診斷常用血清酶的來(lái)源診斷常用血清酶的來(lái)源血清酶血清酶 符號(hào)符號(hào) 來(lái)源來(lái)源