利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄因子RIN調(diào)控的靶基因_圖文

1、·研究報(bào)告·2011年第12期生物技術(shù)通報(bào)BIOTECHNOLOGY BULLETIN收稿日期：2011-05-12基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30871741, 30972037）作者簡(jiǎn)介：李玲，女，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)；E -mail:liling19820925通訊作者：朱本忠，男，副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)；E -mail:cauzbz利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄因子RIN調(diào)控的靶基因李玲1 傅達(dá)奇2 朱毅2 田慧琴2 羅云波2 朱本忠2（1天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)系，天津 300384；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 食品生物技

2、術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）摘 要: 以粉紅期番茄果實(shí)為材料，用含不同濃度甲醛的緩沖液交聯(lián)DNA 和蛋白質(zhì)，利用超聲波將其染色質(zhì)隨機(jī)斷裂成大小為200-1 000 bp的片段，用RIN 蛋白的特異性抗體免疫沉淀與RIN 蛋白結(jié)合的DNA 片段，然后解交聯(lián)和純化DNA 片段，最終用普通PCR 試驗(yàn)和測(cè)序驗(yàn)證與轉(zhuǎn)錄因子RIN 結(jié)合的DNA 序列。結(jié)果表明，適用于番茄果實(shí)的最佳ChIP 試驗(yàn)條件為：用1%甲醛溶液交聯(lián)DNA 和蛋白質(zhì)的復(fù)合物；用20%功率，工作6 s，間隔10 s，脈沖3次超聲破碎該復(fù)合物，可以得到適當(dāng)大小的片段，用于后續(xù)的試驗(yàn)。普通PCR 和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果證明轉(zhuǎn)錄因子RIN 與Le

3、ACS2和LeACS4啟動(dòng)子區(qū)域的CArG box序列結(jié)合。關(guān)鍵詞: 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) 轉(zhuǎn)錄因子RIN L eACS2基因 L eACS4基因 番茄果實(shí)Determining the Target Genes of RIN Transcription Factor byChromatin ImmunoprecipitationLi Ling1 Fu Daqi2 Zhu Yi2 Tian Huiqin2 Luo Yunbo2 Zhu Benzhong2（1Department of Food Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 30

4、0384；2Food Biotechnology Lab，College of Food Science &Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）Abstract: Briefly，tomato tissues were fixed with different concentrations formaldehyde for 10 min（protein to DNA cross-linking），sonicated to shear the DNA into 200-1 000 bp

5、fragments，and then immunoprecipitated with anti-RIN antibody. After that，DNA fragments were extracted，purified，and ultimately detected by the general PCR assay and sequencing experiments. The optimal formaldehyde concentration to achieve efficient and reversible cross-linking turned out to be 1%. Af

6、ter testing various sonication conditions，we used 3 rounds of 6 seconds each at 20% power，which was sufficient to obtain 200-1 000 bp DNA fragments. The results showed that RIN transcription factor bound to the CArG box sequences of LeACS2 and LeACS4.Key words: Chromatin immunoprecipitation RIN tran

7、scription factor LeACS2 gene LeACS4 gene Tomato fruit真核生物基因表達(dá)是一個(gè)十分復(fù)雜而有序的過(guò)程，它是眾多反式因子和順式作用元件相互作用的結(jié)果。研究蛋白質(zhì)與DNA 在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。MADS box 轉(zhuǎn)錄因子家族具有重要的作用，其DNA 結(jié)合域有很高的親和力，能與高度保守的CArG box基元結(jié)合1。RIN蛋白是MADS box 轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在系統(tǒng)乙烯和系統(tǒng)乙烯的過(guò)渡階段有極顯著的作用2,3，而且會(huì)導(dǎo)致LeACS4基因表達(dá)量增加2。2002年，Vrebalov等4指出番茄ripening -i

8、nhibitor（rin ）攜帶編碼MADS box轉(zhuǎn)錄因子的突變基因，不能將乙烯信號(hào)傳遞給下游的成熟相關(guān)基因，導(dǎo)致果實(shí)不能成熟。此后，確定轉(zhuǎn)錄因子RIN 的調(diào)控途徑和其直接靶基因成為特別關(guān)注的研究領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究已經(jīng)證明，RIN融合蛋白有很好的DNA 結(jié)合活性5。Yokotani等6指出RIN 基因可能在LeACS2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用。Ito等7指出RIN 結(jié)合于順式作用元件LeACS2。然而，年第期RIN 蛋白在番茄體內(nèi)調(diào)控乙烯生物合成的機(jī)制仍不完全清楚。在細(xì)胞核中，有一種易被堿性染料染上顏色的物質(zhì)，稱為染色質(zhì)，它是調(diào)節(jié)生物體新陳代謝、遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。真核細(xì)胞的染色質(zhì)由4

9、類分子組成：即DNA、RNA、組蛋白（富含賴氨酸和精氨酸的低分子量堿性蛋白）和非組蛋白。DNA和組蛋白的比例接近于11。染色質(zhì)是一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其形態(tài)隨細(xì)胞周期不同而發(fā)生變化，進(jìn)入有絲分裂時(shí)，染色質(zhì)高度螺旋、折疊形成凝集的染色體。染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）技術(shù)是一種在體內(nèi)研究DNA 和蛋白質(zhì)相互作用的方法。與傳統(tǒng)的研究轉(zhuǎn)錄因子和DNA 相互作用的方法相比，ChIP的優(yōu)點(diǎn)在于能夠在體內(nèi)捕獲轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的相互作用，能在同時(shí)快速地提供一種或者多種基因的調(diào)控機(jī)制，所以有巨大的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，此技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展和完善，被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄

10、調(diào)控因子與特定染色質(zhì)序列之間相互作用等方面的研究，并逐漸成為染色質(zhì)水平基因表達(dá)調(diào)控研究的重要方法。由于能夠靈敏地檢測(cè)目的蛋白與特異DNA 片段的結(jié)合情況，因此可以用來(lái)研究組蛋白修飾在基因表達(dá)中的作用，是全面闡明真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的強(qiáng)有力的工具。特別是ChIP 技術(shù)與DNA 芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合，可用于高通量篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶位點(diǎn)和研究反式作用因子在整個(gè)基因組上的分布情況。該技術(shù)在國(guó)外已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但在國(guó)內(nèi)還鮮有報(bào)道，特別是在使用該技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄因子RIN 的調(diào)控靶基因方面尚屬空白。本研究利用ChIP 技術(shù)確定了轉(zhuǎn)錄因子RIN 的直接靶基因，以期揭示RIN 蛋白調(diào)控乙烯生物

11、合成的機(jī)制。1 材料與方法1.1 材料番茄品種為L(zhǎng)ycopersicon esculentum Mill. cv. AilsaCraig，由美國(guó)番茄種質(zhì)資源中心（Tomato Genetics Resource Center）饋贈(zèng)。番茄在統(tǒng)一的栽培條件下種植，常規(guī)管理，均在花期掛牌，采摘花后46-48 d的粉紅期番茄果實(shí)進(jìn)行ChIP 試驗(yàn)。采摘、運(yùn)輸過(guò)程中避免機(jī)械傷害，挑選大小均勻，成熟度相對(duì)一致，無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械傷的一批果實(shí)作為試驗(yàn)材料。1.2 方法1.2.1 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù) 參照Upstate 公司Chromatin Immunoprecipitation Kit說(shuō)明書，略有修改。首

12、先用甲醛在體內(nèi)固定蛋白質(zhì)和結(jié)合的DNA。取新鮮、健康的粉紅期番茄果實(shí)組織，切成小塊，并用雙蒸水漂洗兩次；將果實(shí)組織浸沒于不同甲醛濃度的PBS 緩沖液中，真空滲透10 min，直到組織呈半透明狀；加入終濃度為0.125 mol/L 的甘氨酸，再滲透5 min 以停止交聯(lián)。棄去緩沖液，用預(yù)冷的雙蒸水漂洗果實(shí)組織兩次，且用液氮速凍。將果實(shí)組織放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮，用研杵迅速研磨成粉末。粉末用預(yù)冷的PBS 緩沖液（含蛋白酶抑制劑）重懸。4，2 500 r/min 離心2-5 min，去掉上清。用1 mL SDS裂解緩沖液（含5 L 蛋白酶抑制劑）重懸。除非特別說(shuō)明，以下所有步驟均按照說(shuō)明書在4下

13、進(jìn)行。通過(guò)超聲波處理，將DNA 剪切成200-1 000 bp大小的片段，離心。上清液用ChIP 稀釋緩沖液稀釋，并用蛋白G 瓊脂糖清潔，以降低非特異性背景。樣品用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，于4搖動(dòng)過(guò)夜。復(fù)合物用蛋白G 瓊脂糖懸浮液收集；然后用試劑盒提供的低鹽、高鹽、LiCl洗脫緩沖液洗一次，再用TE 緩沖液洗兩次。免疫沉淀的染色質(zhì)用新配制的洗脫緩沖液洗去蛋白G。蛋白質(zhì)和DNA 的交聯(lián)復(fù)合物經(jīng)過(guò)處理解交聯(lián)，并用蛋白酶K 消化，以從DNA 中除去蛋白質(zhì)。之后用試劑盒提供的純化柱純化DNA。取適量純化后的DNA 樣品（ChIP和Input）作為模板，進(jìn)行PCR 檢測(cè)。PCR反應(yīng)完畢后，用2%瓊脂

14、糖凝膠電泳觀察結(jié)果。最后將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證ChIP 的試驗(yàn)結(jié)果。1.2.2 PCR 產(chǎn)物序列測(cè)定及分析 對(duì)DNA 樣品的普通PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定工作由上海生工生物技術(shù)公司完成，用DNAMAN（版本4.0）軟件分析測(cè)序結(jié)果。2 結(jié)果2.1 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)甲醛濃度的確定番茄果實(shí)組織用不同濃度的甲醛溶液進(jìn)行真空滲透，直到果肉組織呈現(xiàn)半透明狀。因?yàn)橹挥形磁c蛋白質(zhì)交聯(lián)的DNA 能被提取出來(lái)，所以用苯酚提李玲等：利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄因子RIN 調(diào)控的靶基因生物技術(shù)通報(bào) Biotechnology Bulletin2011年第12期168取的方法來(lái)評(píng)價(jià)DNA 和蛋

15、白質(zhì)的交聯(lián)效率。用含有不同甲醛濃度的緩沖液真空滲透新鮮番茄果實(shí)組織后，用酚仿提取解交聯(lián)之前和解交聯(lián)之后的DNA，結(jié)果（圖1）顯示，甲醛濃度為0%和0.5%時(shí)，不能使DNA 與蛋白質(zhì)充分交聯(lián)；甲醛濃度為3%和5%時(shí)，DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合物不能充分解交聯(lián)；能達(dá)到交聯(lián)效率且保證解交聯(lián)的最佳甲醛濃度是1%。的片段大小也沒有達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)的要求。而用20%功率，工作6 s，間隔10 s，脈沖3次，能夠得到200-1 000 bp大小的DNA 片段，可以用于后續(xù)的試驗(yàn)。2.3 轉(zhuǎn)錄因子RIN 體內(nèi)靶基因的分析 2.3.1 免疫沉淀的DNA 樣品的普通PCR 檢測(cè) 以粉紅期番茄果實(shí)為材料，用1%甲醛在體內(nèi)交聯(lián)

16、DNA 和蛋白質(zhì)。DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合物用RIN 蛋白的特異性抗體和IgG 抗體（陰性對(duì)照）沉淀，沉淀的DNA 樣品用特定的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，且以LeActin 作為對(duì)照。應(yīng)注意，一定要在相應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CArG box 基元附近設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示?；蛎Q引物名稱引物序列（5' -3' ）LeACS2CPACS2F AATTCTTTACGCAATCTTACTAAAT CPACS2R ACCCTTACATCATTTATTATTACAA LeACS4CPACS4F TCACAATTCAATAGTTACAGTTCAT CPACS4R TCAACAAGTACATGG

17、ACTATGAGTG LeACO1CPACO1F GGTCCTAACAGAGTTCGATGGGTTG CPACO1R TTAGGACACTTTGACTGGGATGT LeActinCPActinF CTTGACTATGAACAGGAACTCGAGA CPActinRGCAGTAATTTCTTTGCTCATTCTAT表1 普通PCR驗(yàn)證使用的引物序列M. DL15000 Marker; -. 解交聯(lián)之前的DNA; +.解交聯(lián)之后的DNA圖1 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)的交聯(lián)效率分析2.2 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)超聲波條件的確定在番茄體內(nèi)用甲醛固定DNA 和蛋白質(zhì)復(fù)合物之后，需要用超聲波的手段將其隨機(jī)切斷

18、為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段（200-1 000 bp），結(jié)果如圖2所示。按圖2-A 的超聲波條件，將樣品超聲波之后，得到的片段大于2 000 bp，沒有達(dá)到要求。按圖2-C的超聲波條件，將樣品超聲波之后，得到 A,B,C. 樣品在10%、20%、25%功率條件下超聲之后的結(jié)果, 均為工作6 s，間隔10 s，脈沖3次;1. 未超聲的樣品；2. 超聲之后的樣品；M.DL2000 Marker圖2 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)的超聲處理效率分析圖3結(jié)果顯示，當(dāng)用IgG 抗體沉淀DNA 和蛋白質(zhì)的復(fù)合物時(shí)，均未擴(kuò)增出LeACS2、LeACS4、LeACO1和LeActin 基因的PCR 產(chǎn)物。當(dāng)用RIN

19、蛋A 順式作用元件LeACS4的ChIP PCR分析；B 順式作用元件LeACS2的ChIP PCR分析；C 順式作用元件LeACO1的ChIP PCR分析；M.DL2000 Marker ；1.Input ；2.Blank ；3.IgG ；4.ChIP圖3 R IN 蛋白與乙烯生物合成相關(guān)基因啟動(dòng)子片段的體內(nèi)結(jié)合能力分析年第期白的特異性抗體沉淀DNA 和蛋白質(zhì)的復(fù)合物時(shí)，在ChIP 樣品中擴(kuò)增出了LeACS2和LeACS4條帶（圖3-A、B，泳道4）。對(duì)照試驗(yàn)表明，LeActin序列沒有在免疫沉淀復(fù)合物中擴(kuò)增出來(lái)，但是在Input 樣品中與LeACS2和LeACS4基因序列一樣，是存在的。結(jié)

20、果說(shuō)明LeACS2和LeACS4基因的啟動(dòng)子序列通過(guò)免疫共沉淀得到了富集，RIN蛋白在體內(nèi)與LeACS2和LeACS4啟動(dòng)子區(qū)域上的CArG box結(jié)合。2.3.2 免疫沉淀的DNA 樣品的普通PCR 產(chǎn)物測(cè)序分析 將圖3中免疫沉淀的DNA 樣品的普通PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。利用生物軟件DNAMAN 將測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的LeACS2（X59139）和LeACS4（M88487）啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果（圖4）所示，PCR產(chǎn)物的序列與LeACS2和LeACS4啟動(dòng)子部分序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)RIN 轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)與LeACS2和LeACS4啟動(dòng)子片段結(jié)合。 A.LeACS2 基因ChIP PCR

21、產(chǎn)物與LeACS2基因（X59139）啟動(dòng)子區(qū)域核苷酸序列比對(duì)；B.LeACS4基因ChIP PCR產(chǎn)物與LeACS4基因（M88487）啟動(dòng)子區(qū)域核苷酸序列比對(duì)圖4 ChIP PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)3 討論傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)與DNA 相互作用的方法是凝膠阻滯試驗(yàn)（EMSA）。高等生物的基因組DNA 與DNA 上的結(jié)合蛋白共同組成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，用EMSA 得到的某段DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果，在體內(nèi)則很可能由于染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的存在而使DNA 與蛋白質(zhì)難以接近。因此，在生理狀態(tài)下，這段DNA 很可能并不與其相對(duì)應(yīng)的因子結(jié)合，是沒有功能的。另外，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)本身是動(dòng)態(tài)的，DNA與非組蛋白在生理狀態(tài)

22、下的相互作用通常是瞬時(shí)的，EMSA難以捕捉到發(fā)生在染色質(zhì)上的基因表達(dá)調(diào)控的瞬時(shí)事件。所以，EMSA不足以充分反映生理?xiàng)l件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況。而染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)則可以找出在生理?xiàng)l件下某個(gè)DNA 結(jié)合蛋白與DNA 序列的結(jié)合位點(diǎn)，能夠真實(shí)反映體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的情況8。本研究采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)在體內(nèi)檢測(cè)RIN 蛋白與乙烯生物合成相關(guān)基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不同，植物細(xì)胞有嚴(yán)格的細(xì)胞壁，高水平的纖維素和木質(zhì)素、大液泡，這致使不能將動(dòng)物細(xì)胞的ChIP 技術(shù)直接應(yīng)用于植物細(xì)胞。因此，需要對(duì)番茄果實(shí)組織的染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先要使用真空滲透的方

23、法，以確保DNA 和蛋白質(zhì)交聯(lián)溶液滲入植物細(xì)胞。李玲等：利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)確定轉(zhuǎn)錄因子RIN 調(diào)控的靶基因生物技術(shù)通報(bào) Biotechnology Bulletin2011年第12期170正如Das 等9所強(qiáng)調(diào)的，甲醛交聯(lián)使DNA 與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的步驟是非常重要的。結(jié)果顯示，最佳的甲醛濃度是1%。當(dāng)甲醛濃度更高時(shí)反而不起作用，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊募兹┎荒芎芎玫亟饨宦?lián)或者抑制了葉綠體的降解，導(dǎo)致與葉綠體連在一起的細(xì)胞核中的染色質(zhì)難以純化10。最佳超聲波條件是20%功率，工作6 s，間隔10 s，脈沖3次?？梢愿鶕?jù)ChIP 技術(shù)的使用目的，選擇不同的平均片段大小。例如，大片段（1 000

24、-2 000 bp）推薦用于克隆，小片段建議用于高分辨率的組蛋白修飾圖譜研究11。染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RIN 蛋白在體內(nèi)與LeACS2和LeACS4啟動(dòng)子區(qū)域上的CArG box結(jié)合。RIN 融合蛋白沒有體內(nèi)結(jié)合LeACO1啟動(dòng)子的能力，原因之一可能是轉(zhuǎn)錄因子LeHB -1在番茄果實(shí)體內(nèi)結(jié)合LeACO1啟動(dòng)子片段12。總之，以上結(jié)果說(shuō)明RIN 蛋白在番茄果實(shí)乙烯生物合成過(guò)程中有重要作用，LeACS2和LeACS4是轉(zhuǎn)錄因子RIN 直接結(jié)合的靶基因。這個(gè)結(jié)果為闡明轉(zhuǎn)錄因子RIN 的作用機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。4 結(jié)論適用于番茄果實(shí)的最佳染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)條件為用1%甲醛溶液交聯(lián)DNA 和蛋

25、白質(zhì)的復(fù)合物用20%功率，工作6 s，間隔10 s，脈沖3次超聲破碎該復(fù)合物，能夠得到適當(dāng)大小的片段。轉(zhuǎn)錄因子RIN 與LeACS2和LeACS4啟動(dòng)子區(qū)域的CArG box 序列結(jié)合，且在番茄果實(shí)的成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。參 考 文 獻(xiàn)1 T ang W，Perry SE. Binding site selection for the plant MADSdomain protein AGL15. An in vitro and in vivo study. J Biol Chem，2003，278（30）:28154-28159.2 B arry CS，Llop-Tous MI，Grier

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