第18章_酵母雙雜交系統(tǒng)

1、第十八章第十八章 用酵母雙雜交系統(tǒng)用酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)研究蛋白質(zhì)- -蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用相互作用劉新光劉新光蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性性 蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。主要完成者。 幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNA的的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。作用。研究蛋白質(zhì)相互作用的常

2、用方法研究蛋白質(zhì)相互作用的常用方法酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two hybridization）親和層析親和層析免疫共沉淀免疫共沉淀蛋白質(zhì)交聯(lián)蛋白質(zhì)交聯(lián)基于基于GFPGFP的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的研究方法法噬菌體顯示系統(tǒng)篩選噬菌體顯示系統(tǒng)篩選 酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母酵母中進(jìn)行的，研究中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過報(bào)告基因報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到。的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到。第一節(jié)第一節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng)

3、簡介酵母雙雜交系統(tǒng)簡介 它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。間關(guān)系的技術(shù)。 該技術(shù)既可用來研究該技術(shù)既可用來研究哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物基因組編碼基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究的蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可用來研究高等高等植物植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用?；蚪M編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。一、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立和基本原理一、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立和基本原理經(jīng)典文獻(xiàn)出處經(jīng)典文獻(xiàn)出處vFields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interacti

4、ons. Nature, 1989, 340(6230):245-246 （一）酵母雙雜交系統(tǒng)的建立（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的建立 1989年美國紐約州立大學(xué)的年美國紐約州立大學(xué)的Fields和和Song首先描述首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。 該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過該系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識(shí)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的程的認(rèn)識(shí)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄需要反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：參與，真核生長轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子DNA

5、結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activation domain) 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響, 單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。特定基因表達(dá)的激活因子的功能。 Gal4為酵母半乳糖苷酶基因?yàn)榻湍赴肴樘擒彰富騡al1的轉(zhuǎn)錄激活的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的因子，天然的Gal4分子是由一條由分

6、子是由一條由881個(gè)氨基個(gè)氨基酸殘基組成的多肽鏈。酸殘基組成的多肽鏈。 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于由位于N-末端的末端的1147位多肽構(gòu)成，能識(shí)別位于位多肽構(gòu)成，能識(shí)別位于Gal4基因的上基因的上游激活序列游激活序列(upstream activation sequence，UAS)。 此外，在其此外，在其N-端還具有一段核定位序列。端還具有一段核定位序列。AD由位于由位于C-末端的末端的768881位多肽構(gòu)成。位多肽構(gòu)成。 當(dāng)當(dāng)Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)它們?cè)诳臻g上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)

7、作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。錄因子的活性。 Fields和和Song將兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭將兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4的的DNA-BD與酵母蛋白與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將融合；另一個(gè)是將Gal4的的AD和酵母蛋白和酵母蛋白SNF4融合。融合。 其中，其中，SNF1是一種絲氨酸是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激蘇氨酸的蛋白激酶，酶，SNF4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，是它的一個(gè)結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是這兩種蛋白是已知可以相互作用的已知可以相互作用的。 當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因告基因LacZ的酵母菌株后，通

8、過的酵母菌株后，通過SNFl與與SNF4的的相互作用，相互作用，Gal4的的DNA-BD與與Gal4的的AD靠近靠近, 形形成一個(gè)大的復(fù)合物成一個(gè)大的復(fù)合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。 Gal4的的DNA-BD可識(shí)別位于可識(shí)別位于Gal4效應(yīng)基因的效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合；，并可與之結(jié)合； Gal4的的AD則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，則可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中其他成分結(jié)合，激活激活UAS下游報(bào)告基因下游報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄因子（酵母轉(zhuǎn)錄因子（Gal 4）與與BD-fusion -誘餌（誘餌（bait）與與AD-fusion -獵物或靶蛋白（獵物或靶蛋

9、白（prey or target protein）報(bào)告基因（報(bào)告基因（reporter gene） -Lac Z（編碼（編碼-半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的原理（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneXDNA-BD酵母雙雜交動(dòng)畫演示酵母雙雜交動(dòng)畫演示（英文）（英文） 酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞作為報(bào)道株

10、的酵母雙雜交系統(tǒng)具有作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)許多優(yōu)點(diǎn): v 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒v 具有可直接進(jìn)行選擇的具有可直接進(jìn)行選擇的和特征性和特征性v 酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白相酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白相 互結(jié)合互結(jié)合報(bào)道株報(bào)道株 經(jīng)經(jīng)的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿的、含報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。主細(xì)胞。v 基因組中基因組中是缺失型的是缺失型的v 基因組中引入額外的報(bào)告基因基因組中引入額外的報(bào)告基因、 改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn)：改造后的酵母細(xì)胞的特點(diǎn)：通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌

11、落 表達(dá)表達(dá)“誘餌誘餌”和和“獵物獵物”蛋白；蛋白； 檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)檢驗(yàn)這兩種蛋白表達(dá)后能否激活酵母中的報(bào)告基因。告基因。 做法：首先構(gòu)建能表達(dá)做法：首先構(gòu)建能表達(dá)“誘餌誘餌”和和“獵物獵物”蛋白的表達(dá)載體。該載體中可加入進(jìn)行營養(yǎng)型蛋白的表達(dá)載體。該載體中可加入進(jìn)行營養(yǎng)型篩選的基因。篩選的基因。二、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略二、酵母雙雜交系統(tǒng)的基本策略三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 高敏感性。高敏感性。 原因：原因： 采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；合蛋白過量表達(dá)； 激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)

12、錄起激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體始復(fù)合物，之后又與啟動(dòng)子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定； 通過通過mRNA使信號(hào)放大；使信號(hào)放大； 檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，檢測(cè)的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用。可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時(shí)的相互作用。三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)三、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) 高敏感性。高敏感性。真實(shí)性。真實(shí)性。檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。無

13、需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 簡潔性。簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。廣泛性。廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。蛋白。 分析已知蛋白之間的相互作用分析已知蛋白之間的相互作用 對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺

14、失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用四、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀四、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新

15、的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 的新功能的新功能 將已知基因作為將已知基因作為誘餌誘餌，在選定的，在選定的cDNA文庫中文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體文庫載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片片段，并對(duì)該片段的編碼序列在段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。 利用酶聯(lián)免疫（利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（）、免疫共沉淀（CO-IP）技

16、術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng)，可研究抗原和抗體之間的相互作用，但它們都是基于和抗體之間的相互作用，但它們都是基于體外非細(xì)胞體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細(xì)胞細(xì)胞體內(nèi)體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行檢測(cè)。利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和 抗體的相互作用抗體的相互作用利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及 藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響藥物對(duì)蛋白質(zhì)

17、之間相互作用的影響 對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用對(duì)于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的。用以達(dá)到治療疾病的目的。利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 （Genome Protein Linkage Map） 基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的聯(lián)系。通過基因組的測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和的基因和EST序列。序列。 利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和利用酵母雙雜

18、交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋序列為誘餌，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代圖。對(duì)于認(rèn)識(shí)一些重要的生命活動(dòng)：如信號(hào)傳導(dǎo)、代謝途徑等有重要意義。謝途徑等有重要意義。五、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題的解決和五、酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題的解決和改進(jìn)措施改進(jìn)措施（一）（一） 假陽性較多假陽性較多（二）（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低轉(zhuǎn)化效率偏低（三）（三） 陰性干擾陰性干擾v假陽性定義假陽性定義 在待研究的兩個(gè)蛋白間沒有發(fā)生相在待研究的

19、兩個(gè)蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活。（一）（一） 假陽性較多假陽性較多 BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。這種融合蛋白融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。的激活作用被外來蛋白激活。 如如AD融合靶蛋白有融合靶蛋白有DNA的特異性結(jié)合，則可單的特異性結(jié)合，則可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。 AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報(bào)告基融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報(bào)告基因；因； AD融合靶蛋白與融合靶蛋白與BD相互作用或者相互作用或者AD與與BD融合融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。

20、蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。原因原因：排除假陽性的措施排除假陽性的措施 作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。 采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控采用多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。 報(bào)告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)報(bào)告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。定。 優(yōu)化優(yōu)化3-AT(3-aminotriazole)濃度。適當(dāng)增加濃度濃度。適當(dāng)增加濃度可減少假陽性?？蓽p少假陽性。進(jìn)一步分析：進(jìn)一步分析

21、： 這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生。 有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。們具有普遍的蛋白間的相互作用。 一些實(shí)際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋一些實(shí)際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。白也可發(fā)生相互作用。 酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌酵母轉(zhuǎn)化效率較細(xì)菌低低4個(gè)數(shù)量級(jí)個(gè)數(shù)量級(jí)，轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)化成為雙雜交技術(shù)的化成為雙雜交技術(shù)的瓶頸瓶頸。辦法辦法：引進(jìn)酵母接合型引進(jìn)酵母接合型 a接合型和接合型和 接合型（兩者之間可，但自接合型（兩者之間可，但自身不能形成二倍體）身不能形成二

22、倍體）（二）（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低轉(zhuǎn)化效率偏低 接合型酵母細(xì)胞接合型酵母細(xì)胞cDNA文庫文庫 誘鉺蛋白基因誘鉺蛋白基因多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)DNA-BD 載體載體 AD 載體載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化a接合型酵母細(xì)胞接合型酵母細(xì)胞篩選平板篩選平板生長菌苔生長菌苔篩選平板篩選平板生長菌苔生長菌苔同一個(gè)三重篩選平板同一個(gè)三重篩選平板克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）克?。ㄕT餌與靶蛋白相互作用）鑒定鑒定-半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分已部分已商品化商品化（三）陰性干擾（三）陰性干擾v融合蛋白的表達(dá)融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性對(duì)細(xì)胞有毒性，該怎么辦？該怎么辦？ 應(yīng)選擇應(yīng)選擇敏感性較低敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體的菌株或拷

23、貝數(shù)低的載體v蛋白間的蛋白間的相互作用較弱相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌，應(yīng)選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。株或多拷貝載體。v蛋白在酵母中蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者，或者不能正不能正確地折疊確地折疊，或雜交蛋白，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核不能轉(zhuǎn)入胞核。兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來。達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來。原因：原因： 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互蛋白間相互作用的有效和快速的方法，作用的有效和快速的方法， 有多方面的應(yīng)用，有多方面的應(yīng)用， 但仍存在一些但仍存

24、在一些局限性局限性。六、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)六、酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)局限性局限性 某些誘餌蛋白具有某些誘餌蛋白具有自身激活自身激活性質(zhì)。性質(zhì)。 -雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域除相互作用的結(jié)構(gòu)域 某些蛋白在酵母中某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位定位到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作到胞核內(nèi)。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)噬菌體顯示系統(tǒng)。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間

25、的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)局限性局限性有時(shí)有時(shí)DNA-BD或或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊?；蚱茐牧巳诤系鞍椎恼_折疊。4. 哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊哺乳動(dòng)物蛋白之間相互作用有時(shí)要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。和翻譯后修飾，而酵母細(xì)胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究究 陽性

26、克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原陽性克隆必須進(jìn)行體外翻譯和表達(dá)，用抗原表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。表位特異性的抗體進(jìn)行共定位研究。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證。它的實(shí)驗(yàn)手段來驗(yàn)證。 在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展：在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展：酵母單雜交酵母單雜交-用于核酸和文庫蛋白之間的研究用于核酸和文庫蛋白之間的研究酵母三雜交酵母三雜交-三種不同蛋白之間的互作研究三種不同蛋白之間的互作研究酵母的反向雜交酵母的反向雜交-兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。位點(diǎn)。七、反向雙雜交系統(tǒng)和三雜交技術(shù)七、反向雙雜

27、交系統(tǒng)和三雜交技術(shù)(一一) 酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybrid system) 1993年，由年，由Wang和和Reed等相繼創(chuàng)立發(fā)展等相繼創(chuàng)立發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)體系。相互作用的實(shí)驗(yàn)體系。Wang MM, Reed RR. Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection in yeast. Nature，1993，364(6433):121-126.文獻(xiàn)出處文獻(xiàn)出處酵母單雜交系統(tǒng)原理酵母單雜交系統(tǒng)原理

28、在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交在酵母單雜交系統(tǒng)中，省略了在酵母雙雜交系統(tǒng)中采用的系統(tǒng)中采用的BD-X蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的蛋白質(zhì)雜交體，而用特異的DNA序列取代序列取代DNA Gal4結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)。 該該DNA序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白序列在相關(guān)生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。 靶靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其與其特異特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用可激活作結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用可激活作為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告基因的表達(dá)。為表型選擇性標(biāo)志的報(bào)告

29、基因的表達(dá)。酵母單雜交系統(tǒng)原理酵母單雜交系統(tǒng)原理 理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶理論上，酵母單雜交系統(tǒng)可利用靶DNA序列，序列，捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。捕獲具有與該元件特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。 該系統(tǒng)不僅適用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于該系統(tǒng)不僅適用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子，也適用于研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和研究參與轉(zhuǎn)錄抑制和DNA復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。復(fù)制過程的蛋白質(zhì)。 待篩選的蛋白待篩選的蛋白Y或或BD結(jié)構(gòu)域同結(jié)構(gòu)域同AD結(jié)構(gòu)域融結(jié)構(gòu)域融合，蛋白合，蛋白Y上游序列或上游序列或BD與待目的與待目的DNA序列序列結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合，導(dǎo)致AD激活了報(bào)告基因表達(dá)。激活了報(bào)告基因表達(dá)。酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用酵母單

30、雜交系統(tǒng)應(yīng)用 確定已知確定已知DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白的的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核結(jié)合的核苷酸序列。苷酸序列。 -研究研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用(二二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system ）1996年，年，Vidal等人建立了反

31、向酵母雙雜交系統(tǒng)等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng)Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320. (二二) 反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system ） 該系統(tǒng)

32、是一項(xiàng)鑒定該系統(tǒng)是一項(xiàng)鑒定阻斷阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因。 在這系統(tǒng)中，野生型在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激間的相互作用激活一種活一種毒性標(biāo)志毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的或致死性的，即所謂的陰性陰性篩選。篩選。 在此情況下在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離作用的解離賦予酵母一種賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢(shì)。選擇生長優(yōu)勢(shì)。 利用這種方法能方便地鑒定利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物

33、質(zhì)解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑阻遏蛋白，從而抑制陽性篩選標(biāo)志制陽性篩選標(biāo)志His3的表達(dá)，此時(shí)野生型相互作用使宿的表達(dá)，此時(shí)野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營養(yǎng)缺陷型。主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營養(yǎng)缺陷型。反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 用于篩選缺陷等位基因的研究用于篩選缺陷等位基因的研究 在穩(wěn)定、全長在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾

34、種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因。種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因。 在反式作用解離分子方面的應(yīng)用在反式作用解離分子方面的應(yīng)用 在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用 利用反向雙雜交利用反向雙雜交系統(tǒng)對(duì)文庫進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的系統(tǒng)對(duì)文庫進(jìn)行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。鎖圖譜的設(shè)想。 第一部分第一部分 用酵母雙雜交系統(tǒng)從人睪丸用酵母雙雜交系統(tǒng)從人睪丸cDNA文庫初步篩選與文庫初步篩選與

35、CK2相互作用相互作用蛋白的候選克隆蛋白的候選克隆 1.1 材料材料 pGBKT7-HCK2 梁景耀構(gòu)建梁景耀構(gòu)建 Human Testis MATCHMARKER cDNA Library Clontech公司公司 1.2 方法方法1.2.1 人睪丸組織人睪丸組織cDNA文庫質(zhì)粒的擴(kuò)增與抽提文庫質(zhì)粒的擴(kuò)增與抽提 (1) cDNA文庫的滴度測(cè)定文庫的滴度測(cè)定 (2) 文庫擴(kuò)增：根據(jù)滴度和獨(dú)立克隆數(shù)計(jì)算所需文庫文庫擴(kuò)增：根據(jù)滴度和獨(dú)立克隆數(shù)計(jì)算所需文庫 原始菌液體積及鋪皿個(gè)數(shù)（共涂布原始菌液體積及鋪皿個(gè)數(shù)（共涂布110塊塊LB/Amp 培養(yǎng)基培養(yǎng)基) (3) 收集培養(yǎng)基上生長的菌落，制備文庫質(zhì)粒

36、收集培養(yǎng)基上生長的菌落，制備文庫質(zhì)粒 1 材料與方法材料與方法(二二)反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system ） 毒性報(bào)告基因毒性報(bào)告基因包括包括URA3和和CYH2等。等。 酵母酵母URA3基因產(chǎn)物一方面為合成尿嘧啶所必需，同基因產(chǎn)物一方面為合成尿嘧啶所必需，同時(shí)又能催化時(shí)又能催化5-FOA（5-氟乳清酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)。氟乳清酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)。 URA3既可作為陰性篩選標(biāo)志既可作為陰性篩選標(biāo)志(在含有在含有5-FOA的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中中)、又可作為陽性篩選標(biāo)志、又可作為陽性篩選標(biāo)志(在不含在不含5-FOA的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中

37、)，因此應(yīng)用得更廣泛。因此應(yīng)用得更廣泛。1.2.2 用誘餌質(zhì)粒用誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HCK2篩選文庫篩選文庫 (1) 酵母酵母AH109(pGBKT7-HCK2 ）感受態(tài)制備）感受態(tài)制備(醋酸鋰法）醋酸鋰法） (2) 文庫轉(zhuǎn)化（分步轉(zhuǎn)化法文庫轉(zhuǎn)化（分步轉(zhuǎn)化法) (3) 檢測(cè)文庫轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)文庫轉(zhuǎn)化效率 (4) 初步篩選陽性候選克隆初步篩選陽性候選克隆 轉(zhuǎn)化混合物接種在轉(zhuǎn)化混合物接種在75塊塊SD/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中陽性克隆重新在陽性克隆重新在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)-半乳糖苷酶濾膜影印法初步篩選出陽性候選克隆的轉(zhuǎn)化

38、株半乳糖苷酶濾膜影印法初步篩選出陽性候選克隆的轉(zhuǎn)化株 2 結(jié)果結(jié)果2.1 文庫的擴(kuò)增與抽提文庫的擴(kuò)增與抽提 文庫滴度為文庫滴度為3.4109 cfu /ml ； 文庫轉(zhuǎn)化效率為文庫轉(zhuǎn)化效率為2.3105 cfu/g ； 共得轉(zhuǎn)化子約共得轉(zhuǎn)化子約1.15107 2.2 -半乳糖苷酶濾膜影印分析法鑒定的真陽半乳糖苷酶濾膜影印分析法鑒定的真陽 性克隆結(jié)果性克隆結(jié)果 138個(gè)克隆呈現(xiàn)藍(lán)色，為陽性候選克隆個(gè)克隆呈現(xiàn)藍(lán)色，為陽性候選克隆 3 討論討論酵母株酵母株AH109的表型的表型(Ade-，His-，Leu-， Trp- ）及用以篩選的原理及用以篩選的原理酵母篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性酵母篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性v高嚴(yán)謹(jǐn)性高嚴(yán)

39、謹(jǐn)性v低嚴(yán)謹(jǐn)性低嚴(yán)謹(jǐn)性v最低嚴(yán)謹(jǐn)性最低嚴(yán)謹(jǐn)性 第二部分第二部分 相互作用蛋白的進(jìn)一步確證、相互作用蛋白的進(jìn)一步確證、cDNA序列測(cè)定及其同源性分析序列測(cè)定及其同源性分析 pGADT7-RecAD 載體載體 共轉(zhuǎn)化感受態(tài)共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌酵母菌AH109總總RNAHL-60細(xì)胞細(xì)胞HL-60細(xì)胞細(xì)胞cDNA文庫文庫 人人CK2亞基亞基cDNA重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 Nde I/Pst I 人人CK2cDNApGBKT7誘鉺蛋白基因誘鉺蛋白基因多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)DNA-BD 載體載體 測(cè)序驗(yàn)證測(cè)序驗(yàn)證 驗(yàn) 證 蛋驗(yàn) 證 蛋白 表 達(dá)白 表 達(dá)排 除 自排 除 自主激活主激活接種在接種在S

40、D/-Leu/-Trp/-His/-Ade的的缺陷培養(yǎng)基中缺陷培養(yǎng)基中, 生長生長5-7天天 (可以生長且可以生長且-半乳糖苷酶陽性為真陽性克隆半乳糖苷酶陽性為真陽性克隆)擴(kuò)增純化陽性克隆中質(zhì)粒擴(kuò)增純化陽性克隆中質(zhì)粒DNA 以以T7-Promoter為測(cè)序引物為測(cè)序引物 測(cè)定文庫中與測(cè)定文庫中與CK2亞基相互作用蛋白的亞基相互作用蛋白的cDNA序列序列 用用GenBank 軟件包作序列同源性分析，確定相互作用蛋白名稱軟件包作序列同源性分析，確定相互作用蛋白名稱 提取酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)提取酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109以實(shí)現(xiàn)文庫質(zhì)粒的分離并以實(shí)現(xiàn)文庫質(zhì)粒的分離并與與BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH10

41、9以實(shí)現(xiàn)一對(duì)一回復(fù)性雜交以實(shí)現(xiàn)一對(duì)一回復(fù)性雜交Fig 14 HL-60 cDNA library construction and the two-hybrid screening procedure 圖14 HL-60 cDNA 文庫的構(gòu)建和酵母雙雜交的篩選過程HL-60 cDNA 文庫的構(gòu)建和酵母雙雜交的篩選過程文庫的構(gòu)建和酵母雙雜交的篩選過程陽性候選克隆在陽性候選克隆在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上重新劃線培養(yǎng)培養(yǎng)基上重新劃線培養(yǎng)各挑取各挑取10個(gè)個(gè)-半乳糖苷酶陽性克隆半乳糖苷酶陽性克隆, 提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒 PCR擴(kuò)增文庫質(zhì)粒擴(kuò)增文庫質(zhì)粒cDNA插入片段插入片段限制

42、性酶切分析限制性酶切分析1 方方 法法1.1 陽性候選克隆的鑒定與分組陽性候選克隆的鑒定與分組 (將第一部分實(shí)驗(yàn)中獲得的將第一部分實(shí)驗(yàn)中獲得的124號(hào)陽性候選號(hào)陽性候選 克隆用于進(jìn)一步分析）克隆用于進(jìn)一步分析） 1.2 將從代表性酵母克隆中抽提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌將從代表性酵母克隆中抽提的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109 以實(shí)現(xiàn)文庫質(zhì)粒的分離以實(shí)現(xiàn)文庫質(zhì)粒的分離1.3 單一文庫質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化單一文庫質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化1.4 單一文庫質(zhì)粒自主激活報(bào)告基因的檢測(cè)單一文庫質(zhì)粒自主激活報(bào)告基因的檢測(cè) 1.5 相互作用蛋白的進(jìn)一步確證相互作用蛋白的進(jìn)一步確證一對(duì)一回復(fù)性雜交一對(duì)一回復(fù)性雜交1.6 單一文庫質(zhì)粒

43、插入片段的單一文庫質(zhì)粒插入片段的cDNA序列測(cè)定序列測(cè)定1.7 相互作用蛋白相互作用蛋白cDNA序列同源性分析序列同源性分析 Fig1 Restriction analysis of the PCR products of the frozen strain by AluLane114: the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/Alu 2 結(jié)果結(jié)果2.1 陽性候選克隆的分組情況陽性候選克隆的分組情況 Fig2 Restriction analysis of the same

44、 PCR products of the frozen strain by Hae Lane114: the restreaked frozen strain 4,6,3,11,22,12,15,10,14,16,17,18,21,23 PCR products/ Hae Fig 3 8 PCR band types of plasmid extracts of JM109 transformed by yeast plasmid extracts of the restreaked frozen strainsLane 18: PCR product of 4,21,11,12,6,14,1

45、7,16 transformed JM109 clones respectively 2.2 酵母質(zhì)粒抽提物轉(zhuǎn)化酵母質(zhì)粒抽提物轉(zhuǎn)化JM109 Fig 4 -galactosidase assays of AH109 transformed by library plasmids1: 4#; 2: 6#; 3: 11#; 4: 12#; 5: 14#; 6: 16# ; 7: 17 #；8: 21#； N: negative control；P:positive control 2.3 單一文庫質(zhì)粒對(duì)單一文庫質(zhì)粒對(duì)AH109自主激活實(shí)驗(yàn)自主激活實(shí)驗(yàn) Fig 5 -galactosidase as

46、says of AH109 co-transformed by library plasmids and pGBKT7-HCK plasmids 1: 4#; 2: 6#; 3: 11#; 4: 12#; 5: 14#; 6: 16# ; 7: 17 #； 8: 21#； N: negative control；P:positive control 2.4 一對(duì)一回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn)一對(duì)一回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn) 2.5 AD/文庫質(zhì)粒插入片段文庫質(zhì)粒插入片段cDNA序列測(cè)定結(jié)果序列測(cè)定結(jié)果 及其同源性分析及其同源性分析 Fig6 Partial sequence of pACT2-16-1 plasmids

47、 克隆號(hào)克隆號(hào) 實(shí)際插入片段長度實(shí)際插入片段長度 同源性分析同源性分析 4-1 491 bp 該片段該片段16460 bp與人泛素與人泛素52氨基酸融合蛋白氨基酸融合蛋白 cDNA 37481 bp 100%同源同源 6-1 291 bp 該片段該片段16250 bp與人與人CK2亞基亞基cDNA 8931127 bp 99%同源同源 11-1 699 bp 該片段該片段13663 bp與人核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白與人核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白1 cDNA 8391489 bp 100%同源同源 12-1 543 bp 該片段該片段16514 bp與類似人與類似人NADH脫氫酶脫氫酶4 cDNA 1

48、1741672 bp 99%同源同源 21-2 408 bp 該片段該片段16366 bp與人染色體與人染色體7上的上的BAC 克隆克隆 RP11- 634H22 cDNA 2557125221 bp 100%同源同源 Results of DNA sequencing and homologous analysis 14-1 263 bp 該片段該片段29234 bp與人核糖體蛋白與人核糖體蛋白L37a cDNA 130335 bp 100%同源同源 16-1 427 bp 該片段該片段16406 bp與人轉(zhuǎn)換蛋白與人轉(zhuǎn)換蛋白1 cDNA 13403 bp 100%同源同源 17-1 112

49、0 bp 該片段該片段1181094 bp與人染色體與人染色體19上的上的LLNLR- 278H5 克隆克隆 cDNA64405464 bp 99%同源同源3 討論討論 3.1 AD/文庫質(zhì)粒及其與文庫質(zhì)粒及其與BD質(zhì)粒的分離質(zhì)粒的分離3.2 酵母雙雜交系統(tǒng)的假陽性分析酵母雙雜交系統(tǒng)的假陽性分析3.3 篩選到的篩選到的8種相互作用蛋白的功能及其與蛋白激酶種相互作用蛋白的功能及其與蛋白激酶 CK2 的關(guān)系的關(guān)系 3.3.1 人轉(zhuǎn)換蛋白1的功能及其與蛋白激酶CK2 的關(guān)系 轉(zhuǎn)換蛋白(transition proteins,TPs)，主要有轉(zhuǎn)換蛋白1（TP1） 和轉(zhuǎn)換蛋白2（TP2）兩種類型。 在精

50、子細(xì)胞變態(tài)過程中, 核內(nèi)堿性蛋白質(zhì)經(jīng)歷了由組蛋白 轉(zhuǎn)換蛋白魚精蛋白的轉(zhuǎn)換過程，精子細(xì)胞核由圓形變 為長形, 核高度濃縮。Tnp1基因缺失鼠的精細(xì)胞染色體以異常的形式濃縮，并且DNA 鏈 斷裂增多，成熟的精子形態(tài)異常，精子活動(dòng)力降低。 本實(shí)驗(yàn)首次觀察到TP1與CK2間存在的相互作用，對(duì) 研究CK2在精子發(fā)生中的功能及可能機(jī)制有重要意義。3.3.2 核酸酶敏感元件結(jié)合蛋白1的功能及其與蛋白激酶 CK2的關(guān)系 NSEP1是一種細(xì)胞周期特異的轉(zhuǎn)錄因子，還有YB1、YBX1 、 CSDB、 DBPB 等別名 與細(xì)胞增殖有關(guān)，具有調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA剪接及DNA修復(fù)等眾多功能 通過-干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)

51、導(dǎo)途徑(Jak1/CK2/YB-1途徑)可激活 YB-1核易位 NSEP-1功能眾多，深入研究CK2與NSEP-1之間的關(guān)系，對(duì)了解CK2在精子發(fā)生過程中的信號(hào)調(diào)節(jié)具有重要意義 3.3.3 泛素52氨基酸融合蛋白的功能及其與蛋白激酶CK2的關(guān)系泛素主要通過ATP 依賴性的泛素-蛋白水解酶復(fù)合體通路途徑高效并高度選擇性地對(duì)蛋白進(jìn)行完全或部分降解 這一途經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)許多生理過程，例如細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分化、應(yīng)激反應(yīng)、離子通道、DNA的修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過程中起著十分重要的作用CK2是否通過這一途徑參與眾多的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步探討。3.3.4 核糖體蛋白L37a的功能及其與蛋白激酶 CK2的關(guān)系v核

52、糖體蛋白L37a 是核糖體大亞基中一種重要的蛋白質(zhì)，具有如參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)、正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)育調(diào)控等重要的核糖體外生理功能。vCK2與核糖體蛋白之間的關(guān)系也越來越成為一個(gè)具有吸引力的課題 ：已報(bào)道核糖體蛋白L22，L5，L41與CK2存在相互作用。本課題組黃功華等也篩選出泛素/核糖體蛋白S27a與CK2亞基發(fā)生相互作用3.3.5 NADH脫氫酶4的功能及其與蛋白激 酶CK2的關(guān)系vNADH脫氫酶是電子傳遞鏈中最重要的黃素蛋白，其基因的高表達(dá)可改變膜的通透性，可影響線粒體對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。v本實(shí)驗(yàn)表明NADH脫氫酶4與CK2之間存在相互作用，這與CK2的物質(zhì)代謝功能還

53、是與細(xì)胞凋亡的功能有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。3.3.6 篩選獲得的其它相互作用蛋白 CK2亞基 17-1#、21-1#文庫質(zhì)粒上的插入片段經(jīng)序列同源分析，未找到已知蛋白mRNA序列與之相對(duì)應(yīng)，它們的表達(dá)產(chǎn)物可能是新蛋白 第三部分第三部分 用用GST-pull down 進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)間進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)間的相互作用的相互作用 Experimental Control(GST-Fusion) (GST) GSTTP1GSTGSTTP1GSTWashSDS-PAGEGST沉降示意圖沉降示意圖1 原理原理2.2 方法2.2.1 融合表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-1-TP1構(gòu)建與鑒定 材料與方法2.1 材料 重組人蛋白激酶CK2亞基 陳小文純化并鑒定pACT2-16-1質(zhì)粒和質(zhì)粒和pGEX-4T-1載體的雙酶切和定向重組載體的雙酶切和定向重組 重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌重組質(zhì)粒的篩選重組質(zhì)粒的篩選重組質(zhì)粒的酶切鑒定