大腸桿菌及大腸菌群計(jì)數(shù)方法

1、大腸桿菌和大腸菌群計(jì)數(shù)方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章節(jié)內(nèi)容：傳統(tǒng)檢測大腸菌群和大腸桿菌的方法LST-MUG法檢測冷藏和冷凍食品中的大腸桿菌（除雙殼類軟體動(dòng)物制品外）瓶裝水檢測方法貝類和貝類肉制品檢測方法柑桔類水果汁中大腸桿菌檢測方法大腸菌群和大腸桿菌計(jì)數(shù)的其他方法參考文件大腸埃希氏菌，以前常稱大腸桿菌，于1885年由德國兒科醫(yī)生Theodor Escherich發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于人類和溫血?jiǎng)游锏哪c道中，是人類和動(dòng)物腸道中需氧性共生菌的優(yōu)勢菌群，維持宿主健康部分生理功能必需的腸道菌。大腸埃希氏菌屬腸桿菌科，腸桿菌科包括許多種細(xì)

2、菌，致病菌有沙門氏菌、志賀氏菌、和耶爾森氏菌。雖然大多數(shù)的大腸埃希氏菌為非致病菌，但是當(dāng)宿主免疫力降低或細(xì)菌侵入腸道的外組織或器官時(shí)，可引起腸外感染。某些血清型可產(chǎn)生毒素，為致病性大腸埃希氏菌，可引起人類腹瀉。1892年，Shardinger建議把大腸桿菌作為糞便污染的指標(biāo)。由于大腸桿菌廣泛存在于人類和動(dòng)物中，而在其他地方少見。再者，大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖（以后改為為乳糖）產(chǎn)生氣體。與已知的非產(chǎn)氣致病菌容易區(qū)別開來。 因此，大腸桿菌的檢測已成為水和食品的近期糞便污染指標(biāo)，表明可能含有致病菌。腸道中檸檬酸鹽菌，克雷伯氏菌和腸桿菌能發(fā)酵乳糖，與大腸桿菌的生物型非常相似，使得把大腸桿菌作為健康威脅的指

3、標(biāo)，在實(shí)際應(yīng)用中很復(fù)雜 。于是，大腸菌群這個(gè)術(shù)語用來描述這類腸道菌，大腸菌群不是一個(gè)分類學(xué)上的定義，而是一個(gè)工作定義，指的是一群在35培養(yǎng)48h，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，革蘭氏陰性的芽孢桿菌。1914年，每國公共健康協(xié)會(huì)把大腸菌群作為一個(gè)重要的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。雖然大腸菌群很容易檢測到，但不一定與糞便污染有關(guān)系，因?yàn)樵谧匀画h(huán)境樣品中也常存在。于是，糞大腸菌群就作為糞便污染的指標(biāo)。首先由Eijkman提出，指的是在高溫下發(fā)酵乳糖，是總大腸菌群的亞群，同時(shí)也稱為耐熱大腸菌群。糞大腸菌群的檢測，除水、貝類、貝類養(yǎng)殖水在44.5進(jìn)行，其他所有食品都在45.5進(jìn)行。糞大腸菌群包含絕大部執(zhí)蟪司? 克雷伯氏菌也作為糞大腸菌群,

4、但克雷伯氏菌的檢出被認(rèn)為與糞便污染并無關(guān)系。因此,大腸桿菌又被作為一個(gè)重要指標(biāo)?？焖勹b定大腸桿菌的新方法采用，使檢測大腸桿菌相對容易了。現(xiàn)在,在不同的應(yīng)用中,大腸桿菌,大腸菌群和糞大腸菌群這三種類型作為污染指標(biāo)。大腸菌群常用于水或食品加工過程中衛(wèi)生狀況的指標(biāo)。糞大腸菌群用于貝類和貝類養(yǎng)殖水的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。大腸桿菌用于近期糞便污染或不衛(wèi)生的處理過程指標(biāo)。幾乎所有的檢測方法都是基于發(fā)酵乳糖。最可能數(shù)值法(MPN)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,包括近似確證和完全驗(yàn)證。在檢測過程中,樣品要進(jìn)行系列稀釋。實(shí)驗(yàn)操作要記錄發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的陽性管數(shù),然后進(jìn)行另外兩步實(shí)驗(yàn),利用陽性結(jié)果查統(tǒng)計(jì)表(見附錄2),估計(jì)細(xì)菌的數(shù)量,僅前兩

5、步用于檢測大腸菌群和糞大腸菌群,所有三步用于檢測大腸桿菌。3管 MPN法用于檢測大部分食品,5管 MPN法用于檢測水,貝類和貝類養(yǎng)殖水。10管 MPN法用于檢測瓶裝水或估計(jì)本樣品為受到嚴(yán)重污染.另外還有一種固體平板計(jì)數(shù)法,使用VRBA培養(yǎng),其含有中性紅作指示劑,當(dāng)發(fā)酵乳糖時(shí)產(chǎn)生紅色菌落。還有一種膜過濾法檢測大腸菌群和糞大腸菌群,主要根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸形成不同的菌落顏色。本章節(jié)也介紹熒光法檢測大腸桿菌；檢測貝類的特殊方法；一種簡單的瓶裝水檢測方法；和一種與HACCP法規(guī)中相關(guān)的檢測柑桔類水果汁中大腸桿菌的方法.1. 傳統(tǒng)方法檢測大腸菌群、糞大腸菌群、和大腸桿菌A設(shè)備和材料1.水浴箱：44.5

6、77;0.2，水浴箱中的水應(yīng)高于試管中的培養(yǎng)基液面。2.插入型溫度計(jì)：1-55，大約長55cm，精度為0.1，必須經(jīng)NIST或相關(guān)部門檢測合格3.培養(yǎng)箱：35±1.04.電子天平：感量0.1g，稱量范圍大于2Kg5.均質(zhì)器或均質(zhì)瓶（見第1章）6.無菌吸管：1.0ml和10.0ml7.無菌器皿：（用于樣品處理）8.無菌稀釋用帶蓋玻璃瓶9.菌落計(jì)數(shù)器或同等產(chǎn)品10.長波紫外燈:（-365nm）不超過6w11.PH計(jì)B培養(yǎng)基和試劑煌綠乳糖膽鹽肉湯，2% （M25）LST肉湯（M76）EC肉湯(M49)L-EMB瓊脂（M80）胰蛋白胨（色氨酸）肉湯（M164）MR-VP肉湯（M104）Kos

7、er枸櫞酸鹽肉湯（M72）PCA（標(biāo)準(zhǔn)方法）（M124）Butterfields磷酸鹽緩沖液（R11）或同等稀釋液（貝類除外）Kovacs試劑（R38）V-P試劑（R89）革蘭氏染色液（R32）甲基紅指示劑（R44）結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）（M174）VRBA-MUG瓊脂（M175）EC-MUG培養(yǎng)基（M50）LST-MUG肉湯（M77）0.1%蛋白胨水稀釋液（R56）C、MPN法用于大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的計(jì)數(shù)稱取50g樣品加入高速搗碎杯中，見第1章或現(xiàn)在FDA器械 。冷凍樣品在2-5解凍(18h)，但不要融化。加入450ml 磷酸鹽緩沖液，攪拌2分鐘，如果樣品量小于50g，

8、稱取一半樣品加入足夠體積的無菌稀釋液，制成1：10的樣品液，在搗碎杯中的液體應(yīng)完全覆蓋刀片。稀釋倍數(shù)根據(jù)大腸菌群對樣品的污染情況，用稀釋液將樣品制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，以30cm幅度于7s內(nèi)將樣品振搖25次（或以器械振搖器震蕩）。選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種3管LST，每管接種1ml，以一定的角度，使吸管的尖部在試管壁上停留2-3s，從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不要超過15min。（注意：用5管MPN法檢測貝類食品和貝類養(yǎng)殖水）將接種的LST管放置35培養(yǎng)，檢查和記錄在24±2h時(shí)倒管內(nèi)產(chǎn)氣的試管，未產(chǎn)氣的試管繼續(xù)培養(yǎng)24h，在48±2h

9、時(shí)檢查和記錄產(chǎn)氣情況，對所有產(chǎn)氣的試管進(jìn)行確證試驗(yàn)。D、MPN法大腸菌群確證試驗(yàn)將所有LST肉湯產(chǎn)氣管，用接種環(huán)接種一環(huán)到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯中。置BGLB試管于35培養(yǎng)48±2h，記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表（見附錄2 ），計(jì)數(shù)出大腸桿菌的最可能數(shù)值。E、MPN法糞大腸菌群和大腸桿菌確證試驗(yàn)從產(chǎn)氣LST肉湯管中接種一環(huán)培養(yǎng)物到EC肉湯管中（木制接種棒也可以使用）。將所有接種的EC肉湯管放入帶蓋水浴箱中，45.5培養(yǎng)24±2h，檢查產(chǎn)氣情況。如果不產(chǎn)氣，繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h，檢查產(chǎn)氣情況。按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表計(jì)數(shù)出

10、糞大腸菌群MPN值。繼續(xù)大腸桿菌分析，按以下F部分進(jìn)行。EC肉湯MPN方法可用于海水和貝肉類的糞大腸菌群檢測。注意：除水、貝類和貝類養(yǎng)殖水中的糞大腸菌群檢測的培養(yǎng)溫度為44.5±0.2外，其他所有食品中糞大腸菌群的培養(yǎng)溫度為45.5±0.2。F、MPN法大腸桿菌的完全測定進(jìn)行大腸桿菌完全測定前，輕輕搖勻產(chǎn)氣的EC肉湯試管，取產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)平板（L-EMB），35培養(yǎng)18-24h，檢查L-EMB平板上有無具黑色中心的有金屬光澤或無金屬光澤的扁平菌落。挑取5個(gè)典型菌落接種到PCA斜面培養(yǎng)基上，35培養(yǎng)18-24h，進(jìn)行進(jìn)一步檢測。注意：檢測5個(gè)可疑菌落中任何一

11、個(gè)為大腸桿菌，都可以確證EC肉湯管為陽性。因此，并非5個(gè)菌落都必須檢測。革蘭氏染色：所有為革蘭氏染色陰性短桿菌的培養(yǎng)物，都應(yīng)進(jìn)行IMVIC生化反應(yīng)檢測和重新接種到LST肉湯進(jìn)行產(chǎn)氣確證試驗(yàn)。吲哚試驗(yàn)：將PCA斜面純培養(yǎng)物接種到胰蛋白胨肉湯中，35培養(yǎng)24±2h，加Kovacs氏試劑0.2-0.3ml。上層出現(xiàn)明顯紅色為靛基質(zhì)陽性反應(yīng)。VP試驗(yàn)：將純培養(yǎng)物接種到MR-VP肉湯中，35培養(yǎng)48±2h，以無菌操作稱取培養(yǎng)物1ml至13*100mm試管中，加入0.6ml-萘酚溶液，0.2ml 40%KOH溶液和少許肌酸結(jié)晶。振搖試管后靜置2h。如出現(xiàn)伊紅色，為VP陽性反應(yīng)。甲基紅試

12、驗(yàn)：在VP試驗(yàn)完后，試管中MR-VP培養(yǎng)物剩余部分繼續(xù)在35培養(yǎng)48±2h；滴加5滴甲基紅溶液，培養(yǎng)物變?yōu)槊黠@紅色為甲基紅試驗(yàn)陽性，若變?yōu)辄S色則為陰性反應(yīng)。檸檬酸鹽試驗(yàn)：接種純培養(yǎng)物到KoserS枸櫞酸鹽肉湯中清澈液體，避免接種量過量產(chǎn)生渾濁。35培養(yǎng)96h，培養(yǎng)物為明顯渾濁為陽性反應(yīng)。發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣試驗(yàn)：接種純培養(yǎng)物到LST肉湯中，35培養(yǎng)48±2h，產(chǎn)氣或輕輕搖動(dòng)試管產(chǎn)生氣泡為陽性反應(yīng)。結(jié)果報(bào)告：所有培養(yǎng)物（A）在35培養(yǎng)48±2h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（B）革蘭氏陰性無芽孢桿菌 （C）IMVIC試驗(yàn)為+ + - -或- + - -為大腸桿菌。再根據(jù)EC肉湯中陽性管

13、數(shù)（連續(xù)3個(gè)稀釋度）查MPN表（見附錄2）計(jì)算出每克（毫升）樣品大腸桿菌MPN值。注意：可以選用API20E或VITEK生化分析，鑒定大腸桿菌，替代IMVIC生化試驗(yàn)。G大腸菌群固體培養(yǎng)基測定法按照生產(chǎn)廠家說明制備結(jié)晶紫中性紅瓊脂（VRBA）冷至48時(shí)備用。樣品制備按照以上I.C部分制備。每個(gè)稀釋度分別移取2個(gè)1ml樣品液到2個(gè)滅菌平皿中,根據(jù)細(xì)菌受損和擠壓的程度。取10ml冷至48的VRBA培養(yǎng)基加入平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加入5mlVRBA培養(yǎng)基覆蓋平板表層，以防止細(xì)菌蔓延生長。如果細(xì)菌細(xì)胞受損嚴(yán)重，需要復(fù)蘇修復(fù)，取8-10ml冷至48的胰蛋白胨大豆

14、瓊脂，將培養(yǎng)基與樣品液充分混勻，在室溫中放置2±0.5h，再加入8-10ml冷至48的VRBA培養(yǎng)基覆蓋平板表層。把凝固后的平板，35倒置培養(yǎng)18-24h，檢測乳制品時(shí)，放置32培養(yǎng)18-24h，用帶光源的放大鏡下檢查平板。選用有25-250個(gè)菌落的平板，計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群，典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。為了確證大腸菌群，從VRBA平板至少挑取10個(gè)典型菌落，接種于BGLB肉湯內(nèi)，35培養(yǎng)24h和48h，觀察產(chǎn)氣情況。注意：將出現(xiàn)產(chǎn)氣的BGLB肉湯管判為大腸菌群陽性。對形成菌膜的陽性管應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色，以便挑除革蘭氏陽性桿菌。每克

15、樣品中的大腸菌群數(shù)量等于經(jīng)最后證實(shí)為陽性的試管百分比乘以VRBA上的可疑菌落，再乘以稀釋倍數(shù)。另外一種方法：大腸桿菌可以與大腸菌群進(jìn)行區(qū)別，在每毫升VRBA覆蓋瓊脂中加入100ug MUG，經(jīng)培養(yǎng)后，大腸桿菌在長紫外燈下出現(xiàn)藍(lán)色熒光。（詳見LST-MUG部分）H、膜過濾法(MF)檢測大腸菌群：見部分，瓶裝水檢測。注意：由于大多數(shù)食品容易粘在膜上，因此，MF法最適合于檢測水樣品，MF法也可用于含微量顆粒少的液體食品。.LST-MUG法檢測冷藏和冷凍食品中大腸桿菌(除雙殼類軟體動(dòng)物制品外)LST-MUG法原理基于-葡萄糖苷酶能降解MUG成4-MU，在長紫外燈下時(shí)（365nm），MU在菌落周圍培養(yǎng)基

16、顯示出藍(lán)色熒光，非常容易辨別。95%以上的大腸桿菌產(chǎn)生-葡萄糖苷酶（包括一些不產(chǎn)氣的菌株），而大腸桿菌O157：H7不產(chǎn)生此酶。經(jīng)常通過-葡萄糖苷酶來區(qū)別大腸桿菌與大腸桿菌O157：H7，雖然-葡萄糖苷酶陽性的O157：H7確實(shí)存在。腸桿菌科中除了一部分志賀氏菌（44-58%）和沙門氏菌（20-29%）含有此酶以外，其他細(xì)菌都不含有此酶。因此，從公共衛(wèi)生角度來分析，并不認(rèn)為通過-葡萄糖苷酶來檢測致病菌出現(xiàn)疏忽是一個(gè)缺點(diǎn)。-葡萄糖苷酶的活性是受催化抑制影響的，有些大腸桿菌為-葡萄糖苷酶陰性，甚至有時(shí)攜帶有編碼這個(gè)酶的Vida基因。然而，在研究表明，大約96%的大腸桿菌為-葡萄糖苷酶陽性而不需要此

17、酶的誘導(dǎo)。除一些培養(yǎng)基外，例如EMB培養(yǎng)基，含有一些熒光物質(zhì)，會(huì)掩蓋MU熒光，MUG能加入幾乎任何培養(yǎng)基中進(jìn)行大腸桿菌檢測。當(dāng)MUG加入LST中后，大腸菌群可以通過發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣進(jìn)行檢測，大腸桿菌可以在長紫外燈光觀察熒光進(jìn)行檢測，這樣可以在24h內(nèi)進(jìn)行大腸桿菌近似鑒定。LST-MUG培養(yǎng)基已經(jīng)被AOAC作為對除貝類外的冷藏和冷凍食品的大腸桿菌檢測。對于MUG分析的方法可聯(lián)系Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大學(xué)公園、MD、20740、301-436-1650注意：觀察LST-MUG試管的熒光時(shí)，應(yīng)在黑暗處長紫外燈（365nm）下，手提式6w的紫外燈完全可以滿足要求且非常安全。當(dāng)使用更

18、大功率的紫外燈時(shí)，例15w紫外燈，應(yīng)帶上防紫外線的眼鏡和手套。同時(shí)，在采用MUG方法前，檢測所有玻璃試管是否本身含有熒光，有時(shí)二氧化鈰加入玻璃中進(jìn)行質(zhì)量控制檢測，在紫外燈下會(huì)產(chǎn)生熒光，干擾MUG檢測。因此，在MUG檢測方法中，把陽性菌株和陰性菌株進(jìn)行對照非常必要。1、 設(shè)備和材料：見前面部分I.A玻璃試管：新的、一次性（100*16mm）玻璃試管：新的、一次性（50*9mm）長紫外燈6w或相當(dāng)?shù)摹?、 培養(yǎng)基和試劑：見前面部分I.B3、 LST-MUG法近似檢測大腸桿菌除了LST-MUG肉湯代替LST肉湯外,樣品制備和檢測過程與前面部分I相同,需用-葡萄糖苷酶陽性大腸桿菌(ATCC25922)

19、和陰性腸桿菌(ATCC13048)作對照。35培養(yǎng)24至48±2h,檢查產(chǎn)氣和渾濁的試管，然后在長紫外燈下(365nm)觀察熒光，呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的為大腸桿菌假定陽性。Moberg研究表示，使用熒光方法，24h判定大腸桿菌的準(zhǔn)確度為83-95%，48h后判定準(zhǔn)確度為96-100%。進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)，接種一環(huán)假定陽性試管的培養(yǎng)物到L-EMB培養(yǎng)基上，35培養(yǎng)24±2h，接著往下的操作方法與前面部分I相同。.瓶裝水大腸菌群和大腸桿菌檢測方法瓶裝水的消耗量在全球范圍內(nèi)迅速升高，僅在美國，1988年就消耗了36億加侖的瓶裝水(國際瓶裝水協(xié)會(huì)，Alexandria，VA)不象常用水，是由美

20、國EPA監(jiān)管，瓶裝水在美國法律上定義為食品，是由FDA監(jiān)管。FDA定義瓶裝水為裝在密封瓶中或其他容器中的水，不含有任何添加劑，除一些安全抗菌劑外，在限制范圍內(nèi)，有些被添加了氟化物。瓶裝水本身就是一種飲料或作為其他飲料的一種成分。這些法規(guī)不適合于軟飲料或其他相似飲料，除瓶裝水或飲用水外，在FDA CFR103節(jié)也定義了不同類型的瓶裝水來滿足一定的標(biāo)準(zhǔn)。這些定義包括“自流井水”、“地下水”、 “礦物質(zhì)水”、“純化或純凈水”、 “蘇打瓶裝水”、“泉水”和“井水”。另外“無菌水”美國藥品局定義為經(jīng)無菌檢測后合格的水.在瓶裝水中，大腸菌群并不一定是致病菌，而且很少檢測出，但是作為一個(gè)衛(wèi)生指標(biāo)或可能受到微

21、生物污染的指標(biāo)，大腸菌群作為瓶裝水質(zhì)量控制是一個(gè)非常有用的指標(biāo)。但有些國家也檢測其他的微生物數(shù)量作瓶裝水的質(zhì)量指標(biāo)。在現(xiàn)有瓶裝水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)下，F(xiàn)DA已經(jīng)建立了一套檢測大腸菌群的方法，可通過膜過濾法或10管MPN法。詳細(xì)的標(biāo)準(zhǔn)方法可聯(lián)系Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大學(xué)公園、MD、20740、301-436-16501. 設(shè)備和材料a. 培養(yǎng)箱,35±0.5b. 濾器： 玻璃的,塑料的或不銹鋼的c. 紫外滅菌室,進(jìn)行濾器滅菌d. 過濾管或真空瓶e. 真空源(電動(dòng)真空泵或其他)f. 濾膜:無菌白色或隔柵 直徑47mm,孔徑0.45umg. 平皿:無菌 塑料的 大小50*12

22、mm 帶蓋h. 無齒鑷子2. 培養(yǎng)基a. LST肉湯(M76)b. BGLB肉湯(M25)c. M-ENDO培養(yǎng)基或LES ENDO瓊脂3. 10管近似MPN法檢測和確證大腸菌群在線瓶裝水的檢測：取100ml樣品水，從中取10ml加入2 倍濃度的LST肉湯管中，共10管。35培養(yǎng)24±2h，觀察是否產(chǎn)氣(含有小導(dǎo)管)，或輕輕搖動(dòng)試管，產(chǎn)生氣泡為陽性管。如果為陰性管，繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察是否產(chǎn)氣。確證實(shí)驗(yàn)把產(chǎn)氣的LST管輕輕搖勻，用直徑為3.0-3.5mm的無菌接種環(huán)接種一環(huán)或幾環(huán)到BGLB肉湯中，也可用木制小鉤接種，插入液面下2.5cm處。把接種的BGLB肉湯放置35培養(yǎng)48

23、7;2h，檢查產(chǎn)氣情況。根據(jù)10管MPN表(9221.III)P.9-52(水和污水的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法)計(jì)數(shù)出大腸菌群的MPN數(shù)。4. 膜過濾法檢測大腸菌群過濾樣品液100ml，把膜轉(zhuǎn)移到M-Endo培養(yǎng)基中或LES Endo培養(yǎng)基上，35培養(yǎng)22-24h低倍顯微鏡計(jì)數(shù), 大腸菌群為紅色菌落或暗紅色菌落,并有綠色金屬光澤,有時(shí)菌落中心或整個(gè)菌落顯金屬光澤.確證實(shí)驗(yàn):濾膜上的有金屬光澤的菌落在5-10之間，則分別挑取所有菌落，接種到LST肉湯中，35培養(yǎng)48h。濾膜上的有金屬光澤的菌落10個(gè)以上時(shí),隨機(jī)選取10個(gè)菌落,分別接種到LST肉湯中,任何LST肉湯產(chǎn)氣的培養(yǎng)物,再轉(zhuǎn)接到BGLB肉湯中, 35

24、培養(yǎng)48h,任何BGLB肉湯中產(chǎn)氣的試管,確證為大腸菌群,計(jì)數(shù)出每100ml樣品液中所有大腸菌群數(shù).注意:1998年第20版P.9-60允許同時(shí)接種到LST肉湯或BGLB肉湯中培養(yǎng).由于BGLB有強(qiáng)抑制性,因此,此方法規(guī)定從LST產(chǎn)氣,再轉(zhuǎn)接到BGLB中培養(yǎng)是有更好靈敏度的.貝類和貝肉中大腸菌群檢測方法.官方FDA檢測國產(chǎn)和進(jìn)口的雙貝類全部參考APHA1970年第四版,<<海水和貝類的檢測方法>>.此方法包括傳統(tǒng)的5管MPN法檢測大腸菌群和糞大腸菌群,和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)法,本方法適用于檢測雙貝類、鮮無殼肉、 鮮無殼冷凍肉 和半殼中冷凍雙貝類,不適合于檢測螃蟹、龍蝦和蝦米

25、，或經(jīng)預(yù)處理的雙貝類肉制品,例烘烤、預(yù)炒和熱處理的。許多其他方法用于檢測環(huán)境水和雙貝類養(yǎng)殖水此處不包括。美國EPA進(jìn)行環(huán)境水的檢測，貝類養(yǎng)殖水的質(zhì)量控制，分別由各個(gè)州自行檢測。1. 樣品的制備：隨機(jī)挑選10-12個(gè)貝類，從中稱取200g貝肉液體或貝肉，用200ml無菌磷酸鹽緩沖液或0.5%蛋白胨水進(jìn)行樣品12稀釋均質(zhì)2min。泥土中貝類樣品的分析需在均質(zhì)后2min內(nèi)開始，用0.5%無菌的胰胨水或無菌的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行系列樣品稀釋。2. MPN法-大腸菌群近似檢測和確證取分裝有乳糖肉湯（M74）或LST肉湯（M74）的試管，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：a. 取5支試管，每管加入2ml均質(zhì)液（相當(dāng)于1g貝類）b

26、. 取5支試管，每管中加入2ml 110稀釋液（相當(dāng)于0.1g貝類 ）c. 取5支試管，每管中加入2ml 1100稀釋液（相當(dāng)于0.01g貝類 ）d. 取5支試管，每管中加入2ml 11000稀釋液（相當(dāng)于0.001g貝類）若結(jié)果不準(zhǔn)確時(shí)，需進(jìn)一步稀釋。放置于35培養(yǎng)，余下的實(shí)驗(yàn)方法與1.C部分和上面的1.D相同。但結(jié)果報(bào)告時(shí)，此處是每100g樣品中的MPN數(shù)，而不是1g樣品中的MPN數(shù)。3、MPN法-貝肉中糞大腸菌群的近似計(jì)數(shù)和確證實(shí)驗(yàn)近似的檢驗(yàn)方法同前面的第2部分。確證實(shí)驗(yàn)：從陽性的LST肉湯中，接種一環(huán)到EC肉湯中，置于帶蓋的水浴箱中，44.5±0.2培養(yǎng)24±2h。

27、EC肉湯中產(chǎn)氣的管為確證的糞大腸菌群，根據(jù)前面的方法計(jì)算出MPN數(shù)。4、 MPN法EC-MUG法檢測貝肉中大腸桿菌前面章節(jié)的MUG法也可用檢測貝魚肉中的大腸桿菌，但需稍做修改，由于貝魚肉中含有天然的-葡萄糖苷酶活性，例如：牡蠣肉樣品加入LST-MUG培養(yǎng)基會(huì)產(chǎn)生假陽性。因此， 貝類肉中大腸桿菌檢測，加MUG到EC肉湯中，44.5培養(yǎng)，按傳統(tǒng)5管進(jìn)行糞大腸菌群確證實(shí)驗(yàn)。通過在紫外燈下可以進(jìn)行大腸桿菌的MPN計(jì)數(shù)。貝類中糞大腸菌群的檢測，以EC-MUG肉湯替代EC肉湯，其他的操作方法與部分3相同。檢測EC-MUG肉湯中熒光，還需做3個(gè)對照，一管為大腸桿菌陽性菌，一管為肺炎克雷伯氏菌作熒光陰性對照，一管為空白對照，水浴培養(yǎng)。 待檢測樣品、陽性對照同時(shí)置44.5±0.2培養(yǎng)24h，按上面LST-MUG法檢測熒光。注意有些大腸桿菌不產(chǎn)氣，但熒光陽性。計(jì)數(shù)