碩士論文乙基紫與硫酸皮膚素相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應用（可編輯）

1、碩士論文乙基紫與硫酸皮膚素相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應用 乙基紫與硫酸皮膚素相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應用 ? ? ? ? ? ?目 錄摘要 1ABSTRACT11前 言21.1共振瑞利散射的發(fā)展和應用2 1.1.1光散射現(xiàn)象2 1.1.2瑞利散射2 1.1.3共振瑞利散射21.2硫酸皮膚素研究3 1.2.1硫酸皮膚素的性質(zhì)和應用3 1.2.2硫酸皮膚素含量的測定方法42實驗部分42.1儀器和試劑42.2實驗方法53結(jié)果與討論53.1光譜特征5 3.1.1 RRS光譜5 3.1.2吸收光譜53.2適宜的反應條件6 3.2.1酸度的影響6 3.2.2染料用量的影響6 3.2.3反

2、應速度極其穩(wěn)定性6 3.2.4離子強度的影響7 3.2.5表面活性劑的影響73.3共存物質(zhì)的影響73.4工作曲線83.5分析應用8 3.5.1血清中硫酸皮膚素含量的測定8 3.5.2尿樣中硫酸皮膚素含量的測定8結(jié) 論9參考文獻9乙基紫與硫酸皮膚素相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應用王曉源 (西安文理學院化學與化工系,西安市太白南路 168 號,710065)摘要: 在 pH 5.56.5 的 Britton-Robinson 緩沖溶液中,乙基紫與硫酸皮膚素作用形成結(jié)合產(chǎn)物時將導致溶液共振瑞利散射(RRS)大大增強并產(chǎn)生新的 RRS 光譜,其最大散射峰位于 498 nm 處,另在 327 nm

3、 和 650 nm 處有兩個較弱的散射峰。硫酸皮膚素濃度在 01.6 mg/L 范圍內(nèi),與 RRS 強度有良好的線性關(guān)系。據(jù)此,建立了一種新的測定硫酸皮膚素的分析方法。該法具有高靈敏度,對硫酸皮膚素的檢出限(3)為 5.0 ng/mL,選擇性良好。應用于血清和尿樣中硫酸皮膚素的測定,結(jié)果令人滿意。關(guān)鍵詞:硫酸皮膚素;乙基紫;共振瑞利散射 Resonance Rayleigh Scattering Spectra of Interaction of Dermatan Sulfate with Ethyl Violet and Its Analytical ApplicationWang Xiao

4、yuanDepartment of Chemistry, Xian University of Arts and Science, Xian 710065Abstract:In a buffer medium of pH 5.56.5, a compound complex was formed between Dermatan Sulfate abbreviated as DS and Ethyl Violet abbreviated as EV, leading to a great enhancement of the intensity of resonance rayleigh sc

5、attering RRS and giving a new RRS spectrum. The imum scattering peak is located at 498 nm and two relativetely weaker peaks are located at 327 nm and 650 nm. It was also found that the intensity of RRS was directly proportional to the concentration of DS in the range of 01.6 mg/L. Based on these fac

6、ts, a sensitive method for the determination of DS was proposed. The detection limit 3 of this method was found to be 5.1 ng/ml. Good selectivity of the method was shown by the results of interference test. The proposed method has been used for the determination of total amounts of dermatan sulfate

7、in samples with satisfactory results.Keywords:Resonance Rayleigh Scattering; Dermatan Sulfate; Ethyl Violet 1前言:1.1共振瑞利散射的發(fā)展和應用1.1.1光散射現(xiàn)象 光散射是一種比較常見的自然現(xiàn)象,廣泛存在于光與粒子的作用過程中,是指一束光通過介質(zhì)時,在入射光方向以外的各個方向上觀察到光輻射的現(xiàn)象,它的實質(zhì)是說光波的電磁場與介質(zhì)分子相互作用的過程。光散射與介質(zhì)的不均勻性密切相關(guān),但是除了真空以外的其它所有介質(zhì)都有一定程度的不均勻性,從而產(chǎn)生散射光,由于介質(zhì)的不均勻產(chǎn)生不同種類的散射。當

8、有光入射時,每個區(qū)域成為散射中心,向四面八方發(fā)出相同頻率的次波,這些次波間無固定相位關(guān)系,它們在某方向上的非相干疊加形成了該方向上的散射光。根據(jù)散射光與入射光波長的關(guān)系,光散射可分為:彈性散射、非彈性散射、準彈性散射。在三類散射中,非彈性散射研究是最深入、應用最廣泛的,其次是作為彈性散射的瑞利散射。1.1.2瑞利散射 瑞利散射 Rayleigh Scattering,RS是指散射光波長等于入射光波長,而且散射粒子(通常是分子)遠小于入射光波長的散射。由英國物理學家瑞利提出而得名。瑞利散射是一種發(fā)現(xiàn)較早、研究較多并且應用較廣的光散射,自發(fā)現(xiàn)后經(jīng)歷一百三十多年的發(fā)展與完善,至今已建立了比較完善的理

9、論體系并在物理學、天文學1和化學等很多領(lǐng)域得到了廣泛的應用。其中在化學領(lǐng)域中的應用是:分子量的測定、分子回轉(zhuǎn)半徑、形狀和大小的測定,締合聚合反應過程動態(tài)行為的研究以及一些物理化學參數(shù)的測定等。盡管瑞利散射技術(shù)已得到廣泛的應用并為研究工作提供了大量的信息,但該技術(shù)存在兩大不足:(1)信號水平低,一般僅有入射光強度的千分之一左右;因此必須使用價格昂貴的激光光源,這不僅不能提供較完整的瑞利散射光譜,而且即便使用激光光源,對于研究一些極稀溶液中物質(zhì)的濃度和結(jié)構(gòu)信息也非常困難;(2)選擇性低,不同物質(zhì)均遵守瑞利定律,無特征峰,因此限制了它的應用。若在散射實驗中,選擇入射光波長接近待測物質(zhì)的吸收帶時,該物

10、質(zhì)的散射會大大增強,而且會出現(xiàn)新的散射特征,這就是共振瑞利散射,它的出現(xiàn)大大彌補了瑞利散射的不足,并使散射技術(shù)得到了新的研究和應用。1.1.3共振瑞利散射 共振瑞利散射 Resonance Rayleigh Scattering,RRS 是指當入射光位于或接近于分子吸收帶時,由于電子吸收電磁波頻率與散射頻率相同,電子因共振而強烈吸收光的能量并產(chǎn)生再次散射。這種吸收-再散射過程稱為共振瑞利散射或共振增強瑞利散射。人類于 1978 年用宏觀波動理論對最大吸收附近的瑞利光散射進行了理論處理,在此基礎(chǔ)上 Anglister 和 Steinberg 進行了修正,以包括溶質(zhì)最大吸收處的散射光2。上述理論不

11、僅與大量實驗事實相吻合3 , 而且為研究溶質(zhì)分子的聚集狀態(tài)奠定了理論基礎(chǔ)。 共振瑞利散射與瑞利散射相比,具有以下優(yōu)點:有更高的靈敏度、檢測更為方便、有更好的選擇性、可為研究分子結(jié)構(gòu)和反應特征提供更豐富的信息及共振瑞利散射對于大分子非鍵作用。 共振瑞利散射的分析應用及其發(fā)展前景:20世紀30年代,Plazek 在預測共振 Raman 散射的同時預測了有共振 Rayleigh 散射現(xiàn)象的存在。但直到1975年才由Bauer等人發(fā)現(xiàn)并用于研究二苯基卟啉。80年代以后Miller利用宏觀波動理論對其進行了理論研究。后來Anglister等人對該理論進行了修正,使共振瑞利散射理論進一步得到完善。1993

12、年 Pasternack等第一次在熒光分光光度計建立了共振光散射技術(shù),并用該技術(shù)研究卟啉類化合物在核酸分子上的J型堆積,此技術(shù)率先用于核酸的研究和檢測4,隨著后來的研究顯示出該方法在生物大分子的識別、組裝、超分子排列5以及多個分析領(lǐng)域的應用前景很好,這一成果引起了國內(nèi)分析工作者的濃厚興趣和廣泛關(guān)注。在我國,劉紹璞教授等率先應用并研究小分子之間靜電引力、疏水作用和電荷轉(zhuǎn)移作用形成離子締合物而產(chǎn)生的強烈共振瑞利散射信號,從另一角度豐富和拓展了研究內(nèi)容。目前,共振瑞利散射技術(shù)已成功的應用于生物大分子,如蛋白質(zhì)6-8、核酸9-12的研究;抗生素13,14和一些天然藥物15,16的分析應用;以及表面活性

13、劑和有機物分析;也可用于液相納米粒子17-19的分析和表征以及某些物理化學參數(shù)20的測定。自1993年以來,共振瑞利散射技術(shù)由于靈敏度高、儀器簡單便宜,已得到了廣泛的應用,熒光儀和別的分析儀器的聯(lián)用也得到了較好的發(fā)展,如:共振散射技術(shù)與流動注射聯(lián)合使用分析測定肝素;共振散射技術(shù)和高效液相色譜和毛細管電泳儀的聯(lián)用。隨著科學研究和分析技術(shù)的不斷發(fā)展,目前所使用的儀器,如果狹縫過寬,共振瑞利散射光譜中存在動態(tài)的成分,且不利于光譜精細結(jié)構(gòu)的研究;如果狹縫過窄,雖然可能得到較為純凈的共振瑞利散射增強信號,但由于氙燈發(fā)出的能量小,檢測器檢測到信號較弱,影響分析方法的靈敏度。隨著激光技術(shù)的進一步發(fā)展,有望采

14、用大些功率的激光光源進行光譜精細結(jié)構(gòu)研究,并進一步提高檢測的靈敏度。盡管共振瑞利散射技術(shù)得到了廣泛的應用,但對它的產(chǎn)生機理研究還有很多不夠清楚的地方,有些實驗現(xiàn)象和結(jié)果還不能得到很好的解釋,所以,該技術(shù)要得到進一步的完善和成熟,就還有很多工作要做,在這些未知領(lǐng)域得到更清楚的認識后,共振瑞利散射技術(shù)會更加完善并得到廣泛的應用。1.2硫酸皮膚素研究1.2.1硫酸皮膚素的性質(zhì)和應用 多糖分子因具有廣泛的生物活性功能受到廣泛的關(guān)注。比較常見的生物活性功能有:作為植物、動物骨架的原料,能量儲存形式,復雜的生物功能如血型決定簇、細胞識別等。糖胺聚糖是重要的多糖,由重復的二糖結(jié)構(gòu)單元組成,帶有負電荷的長鏈,

15、作為蛋白聚糖的一部分,廣泛存在于脊椎動物組織的細胞外基質(zhì)中,具有許多方面的生物活性,多數(shù)無毒,是當前藥物研究的熱點之一。糖胺聚糖主要包括硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、硫酸類肝素和肝素。肝素具有抗凝血作用,在血滲析和體外血循環(huán)中起到防止血液凝固的作用,還可防止血栓生成。透明質(zhì)酸可增加關(guān)節(jié)間的潤滑性,在劇烈運動時起減震作用,使關(guān)節(jié)免受傷害。 硫酸皮膚素(Dermatan Sulfate,DS)是在哺乳動物真皮中發(fā)現(xiàn)的一種黏多糖類化合物。DS以L-艾杜糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸所形成的二糖單位的重復結(jié)構(gòu)為主體。性狀為凍干粉末,無臭,無味,易吸濕,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮。D

16、S是一種新型的抗血栓藥物,具有抗凝、抗栓、抗炎、抗病毒、抗增殖以及保護血管壁等作用,而且還具有生物利用度高、出血副作用小、口服可吸收等優(yōu)點,故已開發(fā)成為一類很有前途的新型抗血栓藥物。目前,國際上所用的DS藥物多由意大利米蘭 Medlolanum 藥廠提供,是豬腸黏膜 DS制劑,而國內(nèi)該藥物還暫未有成品上市,正處于研發(fā)試驗階段。因此,對硫酸皮膚素進行深入研究是一項非常重要和緊迫的任務(wù)。1.2.2硫酸皮膚素含量的測定方法 目前國內(nèi)外對硫酸皮膚素的分析測定方法研究甚少,主要有:電泳層析法,高效液相色譜法,重量分析法等。上述方法存在較大的不足,有的操作復雜、需要預先分離提純、有的靈敏度不高、選擇性較差

17、、有的儀器價格比較昂貴等缺點。因此進一步研究靈敏度高、選擇性好、操作性簡便的新方法具有重要的研究意義。近幾年來,共振瑞利散射光譜分析法RRS 作為一種新的分析技術(shù),用于多糖、核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的分析,獲得了極高的靈敏度,且具簡易性,為大分子分析開辟了一條新途徑。2 實驗部分2.1 儀器和試劑 RF-5301PC 熒光分光光度計日本島津公司;TU-1810 紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;PB-10 酸度計北京賽多利斯科學儀器。 硫酸皮膚素(美國Sigma公司)標準溶液:準確稱取0.1000 g硫酸皮膚素于50 mL燒杯中,加水溶解后,轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中,以水定容

18、,此儲備液濃度為1 mg/mL,冰箱保存,使用時稀釋至10 g/mL工作液;乙基紫(美國Chroma公司)水溶液:2.0×10-4 mol/L;Britton-Robinson 緩沖溶液:用0.04 mol/L H3PO4 ,H3BO3 和 CH3COOH與 0.2 mol/L NaOH 按照一定比例混合,配成不同 pH 值的緩沖溶液,并用酸度計校正 pH 值。 所用試劑除特別說明外,均為分析純,水為蒸餾水再經(jīng)Simplicity185型離子交換純水器交換提純。2.2 實驗方法 在10.0 mL比色管中,依次加入適量的DS標準溶液、1.0 mL pH 6.0的Britton-Robi

19、nson 緩沖溶液、0.6 mL 2.0×10-4 mol/L EV 溶液,加水稀釋至刻度,搖勻,放置10 min。在熒光分光光度計上,選擇激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm,以exem進行同步掃描,記錄共振瑞利散射光譜,并于 498 nm 處分別測量離子締合物的 RRS 強度 IRRS 和試劑空白的 RRS 強度 I0RRS ,計算:IRRS IRRS - I0RRS 。3 結(jié)果與討論3.1 光譜特征3.1.1 RRS 光譜 按 2.2 實驗方法,在 RF-5301 PC 熒光分光光度計上分別對試劑空白、DS 溶液和離子締合物溶液用 0 nm 進行同步掃描,得到 RRS 光譜,如見圖

20、 1 所示。從圖 1 可知,DS 和 EV 本身的 RRS 均非常微弱,幾乎無峰,但當兩者反應形成大分子離子締合物時,共振瑞利散射顯著增強,并在 327 nm、498 nm 和 650 nm 處產(chǎn)生三個清晰的散射峰。圖 1 DS-EV體系的RRS光譜圖 Fig.1 RRS spectra of DS-EV system 1:DS;2:EV;311:DS-EV pH6.0;c EV 1.2×10-5 mol/L;cDS1 1.0 g/mL; cDS 311: 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 ,1.4,1.6,1.8g/mL3.1.2 吸收光譜 按 2.2 實驗方法配制溶

21、液,以試劑空白為參比,在 TU-1810 紫外可見分光光度計掃描,得到 DS-EV 體系的吸收光譜如圖 2 所示。由圖可知,締合物有 3 個吸收峰分別位于 311 nm、552 nm 和 596 nm 處,可見共振瑞利散射光譜與吸收光譜有很好的對應關(guān)系,其瑞利散射峰分別位于或接近相應的吸收峰,在這些波長處通過散射-吸收-再散射過程,產(chǎn)生共振增強效應,使瑞利散射強度顯著增強。 圖 2 DS-EV 體系的吸收光譜 Fig.2 Absorption spectra of the DS-EV system pH6.0;c EV1.2×10-5 mol/L;cDS 1.0 g/mL3.2 適宜

22、的反應條件3.2.1 酸度的影響 利用不同 pH 的 Britton-Robinson 緩沖溶液研究了酸度對體系 RRS 強度的影響如圖 3 所示。由圖可知,在 pH 值在 5.56.5 范圍內(nèi),體系 RRS 強度達到最大且基本恒定,實驗選用 pH 為 6.0 的 Britton-Robinson 緩沖溶液,最佳緩沖用量范圍為 0.52.0 mL,選用 1.0 mL。 圖3酸度的影響圖 4 EV的影響 Fig.3 Effect of pHFig.4 Effect of EV3.2.2 染料用量的影響 固定 DS 的濃度為 1 g/mL,改變 EV 溶液的用量,試驗了 EV 對體系 RRS 強度

23、的影響如圖 4 所示。由圖可知,當 2.0×10-4 mol/L 的 EV 溶液的用量為 0.6 mL 時,體系的 IRRS 值最大且恒定。3.2.3 反應速度及其穩(wěn)定性 在室溫下,實驗了試劑空白的 RRS 強度 I0RRS 隨時間的變化如表 1 所示,由表 1 可知,DS 與 EV 在 15 min 內(nèi)即可反應完全,瑞利散射強度 IRRS 達最大,此后,締合物體系 IRRS 至少在 4 h 基本不變。實驗選擇反應時間 15 min 后進行測定。 表 1 時間的影響 Tab.1 Effect of time時間/min510152030 60120240300IRRS607.3624

24、.7628.7638.4644.3643.6646.9633.8589.13.2.4 離子強度的影響 加入強電解質(zhì) NaCl考察了離子強度對體系RRS散射強度的影響。結(jié)果表明,試劑空白的RRS強度I0RRS 受離子強度的影響很小,而離子締合物的RRS強度IRRS 在 cNaCl 0.02 mol/L時基本不變,但進一步增大 NaCl 的濃度時,隨離子強度增加,體系變得不穩(wěn)定,隨時間變化,IRRS 降低。3.2.5 表面活性劑的影響 實驗了濃度為 0.01% 的非離子表面活性劑:聚乙烯醇(PVA)、陽離子表面活性劑:溴化十六烷基吡啶(CPB)、陰離子表面活性劑:苯磺酸鈉(SDS)對體系共振瑞利散

25、射的影響。實驗發(fā)現(xiàn),體系的 IRRS 幾乎不隨著 PVA 用量的增大而改變。但隨著 CPB 用量的增大,體系的 IRRS 先增大后減小,分界點為 0.3 mL。對于 SDS 來說,單是試劑空白就產(chǎn)生了強烈的峰信號,說明 EV 與 SDS 生成新的締合物。3.3 共存物質(zhì)的影響 按 2.2 實驗方法,考察了共存物質(zhì)對 DS-EV 體系共振瑞利散射測定 1.0 g/mL DS 的干擾情況如表 2 所示。結(jié)果表明,當測定誤差小于 +5% 時,共存物質(zhì)的允許量(以 g 計)如表 2 所示:表 2 共存物質(zhì)的影響Tab.2 Effect of coexistent substances干擾離子 最大允許

26、量 干擾離子 最大允許量干擾離子 最大允許量 / g/mL / g/mL / g/mL肌 醇 12000Cl- 800 Ca2+ 75葡萄糖7000 L-脯氨酸 500 I-30麥芽糖6000 L-色氨酸 500 Mg2+ 30尿素 4500L-苯丙氨酸 400 NH4+ 30亮氨酸4500SO42- 400 Zn2+ 20硼砂 4000煙酸 300溶菌酶 10甘氨酸1500DL-天冬酸 200 Fe3+ 10乳糖 1500淀粉 100 Cu2+ 5檸檬酸鈉 1200注: Fe3+ 的允許量較小,加 1.5 mL 3.0 mg?mL-1 的焦磷酸鈉溶液掩蔽,可使 Fe3+ 允許量提高至 10

27、倍?？梢?方法有良好的選擇性。4 工作曲線 在確定的最佳反應條件下,取不同量的 DS 標準溶液,按 2.2 實驗方法繪制工作曲線如圖 5 所示。由圖可知,DS 的濃度在 01.6 g/mL 范圍內(nèi)與體系的相對 RRS 強度 IRRS 呈線性關(guān)系,線性回歸方程為:I=531.85c+74. 22,相關(guān)系數(shù) r 為 0.9980,其檢出限 3 為 5.0 ng/mL。 圖 5 DS溶液的標準曲線Fig.5 Standard curve of DS3.5 分析應用3.5.1 血清中硫酸皮膚素含量的測定21 取正常人的血清 2.0 mL ,加入 3.0 mL 甲醇,再離心 15 min (4500 r

28、/min)即可將蛋白質(zhì)分離完全,吸取上清液 1.0 mL 稀釋至 25.0 mL。取 1.0 mL 血樣與 10.0 mL 比色管中,按 2.2 實驗方法測定 DS 含量,并用標準加入法檢驗了方法的相對標準偏差(RSD)和回收率,結(jié)果見表 3 。 表 3 血清中 DS 的測定結(jié)果和回收率Tab.3 Results for the determination of DS in blood項目W1 / g/mL W2 / g/mL W/ g/mLRSD / % 回收率 / %血清1.0不存在 0.99 0.97 1.002.2 98.7 0.97 1.01 0.98注:W1:加入量 ,W2:原有量

29、 ,W:測得總量。3.5.2 尿樣中硫酸皮膚素含量的測定 取新鮮的正常人尿樣,過濾除去尿樣中雜質(zhì),然后取 1.0 mL 尿樣于10.0 mL 比色管中,按 2.2 實驗方法測定 DS,并用標準加入法檢驗了方法的相對標準偏差(RSD)和回收率,結(jié)果見表 4 。 表 4 尿樣中 DS 的測定結(jié)果和回收率Tab.4 Results for the determination of DS in urine項目W1 / g/mL W2 / g/mL W / g/mLRSD / % 回收率 / %尿樣 1.0不存在0.98 0.99 0.972.198.0 0.98 0.98 0.98注:W1:加入量 ,

30、W2:原有量 ,W:測得總量。結(jié)論: 在弱酸介質(zhì)中,乙基紫與硫酸皮膚素作用形成大分子締合物,導致溶液共振瑞利散射大大增強并產(chǎn)生新的 RRS 光譜,其最大散射峰位于 498 nm 處。據(jù)此建立了一種測定痕量的硫酸皮膚素的新方法。該方法簡單,快速和靈敏度高,可用于血清和尿樣中硫酸皮膚素的測定,結(jié)果令人滿意,具有較好的應用前景。 參考文獻1 Kuiper G.R,The Atmospheres of the Earth and planets 2nd M.Ed,Chicago,Univ.of ChicagoPress, Chap.12.2 Anglister J , Steinberg I Z. D

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