實驗七基因組DNA的制備

1、實驗十、基因組實驗十、基因組DNA的提取的提取一、概述一、概述 染色體DNA 通常用于構(gòu)建基因組文庫和Southern雜交，同時在目前廣受人們關(guān)注的生物基因組學(xué)研究中是最重要的研究目標。1、基因組文庫的構(gòu)建：、基因組文庫的構(gòu)建：當用于構(gòu)建基因組文庫時，所得的染色體DNA的片段長度應(yīng)盡可能的長（至少應(yīng)大于需克隆片段的4倍）。當用Cosmid構(gòu)建文庫時，片段長度應(yīng)大于200kb;用噬菌體構(gòu)建文庫時應(yīng)大于80kb。但在制備過程中，有機溶劑的抽提、震蕩、反復(fù)抽提和乙醇沉淀等步驟都會造成DNA斷裂。我們應(yīng)盡可能采用溫和的方法和手段。2、Southern雜交：雜交：用于Southern雜交的染色體DNA片

2、段長度要求可適當降低。3、PCR AFLPRFLP等：等：DNA片段長度要求可適當降低。一、概述一、概述 不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同；同種生物的不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時，必須參照文獻和經(jīng)驗建立的相應(yīng)提取方法，以獲得可用的DNA大分子。二、植物基因組二、植物基因組DNA提取提取(水稻和其它禾本科植物)1、試劑、試劑 A. 提取緩沖液 ：100mmol/L TrisCl（pH8.0）、 20mmol/L EDTA、500mmol/L NaCl、1.5% SDS。 B. 氯仿/戊醇/乙

3、醇溶液: 80：4：16/氯仿：戊醇：乙醇 C. 異丙醇 D. TE: 10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高壓蒸氣滅菌15分鐘, 儲存于4 冰箱。 E. RNase A：10mg/ml F. 3mol/L NaAC2、實驗步驟、實驗步驟A. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液提取緩沖液，60水浴預(yù)熱。B. 水稻幼苗或葉子5-10g ，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60水浴保溫30-60分鐘（時間長，DNA產(chǎn)量高），不時搖動。C.加入20ml 氯仿氯仿/戊醇戊醇/乙醇乙醇溶液，顛倒混勻（需帶手套，

4、防止損傷皮膚），室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機相分層（必要時可重新混勻）。D.室溫下5000rpm 離心5分鐘。E. 仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入一倍體積異丙醇異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。F. 在1.5ml eppendorf管中加入1ml TE。用勾狀玻璃棒撈出DNA絮團，在干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。G.如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。2 2、實驗步驟、實驗步驟( (續(xù)）續(xù)）H. 將DNA溶液30

5、00rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。I.I. 加入5ulRNase A（10ug/ul），3710分鐘，除去RNA（RNA對DNA的操作分析一般無影響，可省略該步驟）。J.J. 加入1/10體積的3mol/L NaAC NaAC及2x體積的冰乙醇冰乙醇，混勻，-20放置20分鐘左右，使DNA形成絮狀沉淀。K.K. 用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。L.L. 將DNA重新溶解于1mlTE中，-20貯存。M.M. 取2ul DNA樣品在0.7%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時可取15ul 稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA

6、含量及質(zhì)量。 3、注意事項、注意事項A、不同的植物材料提取的方法有差異，主要在提取緩沖液的成分上，如李、蘋果的植物的染色體DNA提取所用的提取緩沖液為：18.6g葡萄糖、6.9g二乙基二硫代碳酸鈉（Sarkosyl）、6.0gPVP、240ul巰基乙醇、加水至300ml。B、DNA純度：純度：DNA的OD260/OD280一般為1.8左右。 OD260/OD280 1.8：說明較純； OD260/OD2801.8：說明可能有RNA污染； OD260/OD2801.8：說明可能有蛋白質(zhì)污染。C、DNA濃度濃度：當OD260為1時，dsDNA含量為50ug/ml, ssDNA或RNA含量為40 g

7、/ml；單鏈寡核苷酸為20 ug/ml. dsDNA（g/ml） = 50 OD260 稀釋倍數(shù)V-gene 動動/植物組織細胞基因組植物組織細胞基因組DNA小量純化試劑盒小量純化試劑盒1、基本原理： 該試劑盒采用公司自身研制的相分離技術(shù)和DNA制備膜選擇性吸附DNA 的原理從1-10mg新鮮動物組織或2-20mg新鮮植物組織中提取至多20ug純凈的染色體DNA. 2、實驗步驟、實驗步驟 樣品收集：100mg 新鮮植物葉片，剪刀成小塊，放入研缽中，加入液氮，使植物組織冷凍完全后，快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應(yīng)間斷加入液氮防止組織融化。研磨充分后將研缽放入65水浴至樣品粉末剛開始融化。 加入7

8、00ul buffer G-L 溶液溶液和1.2ul RNase A1貯存液，用力研磨30秒。 轉(zhuǎn)移650ul研磨好的勻漿至2ml離心管中，如體積不到650ul, 加buffer G-L 溶液溶液至650ul, 65下保溫15min。 加400ul bufferG-B溶液和溶液和1ml buffer DV (4 預(yù)冷）預(yù)冷），用力混勻， 12000g離心2min. 去上相液體，保留間相和下相溶液。加入1ml buffer DV (4 預(yù)冷）預(yù)冷），用力混勻， 12000g離心2min. 去上相液體，將下相溶液轉(zhuǎn)移至Filter(置于2ml離心管中）。12000g離心30秒。2、實驗步驟、實驗步

9、驟棄上相，在過濾液中加入400ul buffer DV ,混合均勻。將DNA prep Tube置于2ml 離心管中，加入步驟7的樣品。12000g離心30秒。棄濾液，將DNA prep Tube置于原2ml 離心管中, 加入500ul Wl 溶液溶液，12000g 離心30秒。棄濾液，將DNA prep Tube置于原2ml 離心管中, 加入700ul W2 溶液溶液，12000g 離心30秒。棄濾液，將DNA prep Tube置于原2ml 離心管中, 加入500ul W2溶液溶液，12000g 離心1min。將DNA prep Tube管移入新的1.5 ml離心管中，在DNA制制備膜備膜

10、正中央加100-200l水或Eluent，室溫靜置lmin。最高速度離心l min洗脫DNA。三、細菌基因組三、細菌基因組DNA提取提取1、 試劑試劑A. CTAB/NaCl 溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，緩慢加入10 g CTAB, 加水至100ml.B. 氯仿：異戊醇（24：1）; C.苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）D. 70%乙醇，E.TE, F.10%SDS, G. 蛋白酶K(20mg/ml), H. 5mol/L NaCl.I.RNase A：10mg/ml2、實驗步驟：、實驗步驟：A. 5 ml細菌培養(yǎng)過夜，12000rpm離心3分鐘，去上清液。B. 加567

11、ul TE溶液懸浮沉淀，并加30ul 10% SDS, 3ul蛋白酶K(20mg/ml), 混勻，37水浴保溫1小時。 C. 加100ul 的5mol/L NaCl,混勻。D. 加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻，65水浴保溫10min.E. 用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，12000rpm離心3分鐘。F. 仔細移取上清液至另一離心管中，加入一倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置10min, 即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。G. 用勾狀玻璃棒撈出DNA絮團，在70%乙醇中漂洗后在干凈吸水紙上吸干，室溫下干燥后轉(zhuǎn)入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20。H. 取2ulDNA樣品在0

12、.7%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。 同時取15ul稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質(zhì)量。附注A. 如需降解RNA, 則在步驟G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37保溫30分鐘，除去RNA（RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。B. 用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇抽提，5000rpm離心10分鐘。C. 上清液至另一離心管中，加入1/10體積的3mol/L NaAC及2x體積的冰乙醇，混勻，-20放置20分鐘左右，使DNA形成絮狀沉淀。D. 用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。E. 將DNA重新溶解于1ml

13、TE中，-20貯存。V-gene細菌基因組細菌基因組DNA小量制備試劑盒小量制備試劑盒實驗步驟實驗步驟： 樣品收集：1ml 細菌培養(yǎng)液5000rpm離心3分鐘，用0.8ml細菌原生質(zhì)體制備緩沖液懸浮沉淀，加20ul溶菌酶貯存溶菌酶貯存液液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25M EDTA,pH8.0, 混合均勻，冰上放置5min。 加0.3ml洗脫液，37保溫5min.5000rpm離心5min. 去上清，加0.1mlS-G溶液溶液，徹底懸浮沉淀，冰浴5min. 加0.45ml50預(yù)熱的G-A溶液溶液，用1ml槍頭快速吸注10次；若太粘稠，則在45下保溫5min, 再用1ml槍頭快速吸注10次。冰浴5min. 加0.15mlG-C溶液溶液，混勻，12000rpm離心1min. 將樣品加于微量濾器微量濾器（置于2ml離心管中），12000rpm離心1min.實驗步驟（續(xù)）實驗步驟（續(xù)） 吸取步驟中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管中)，3600rpm離心1min。如制備管中有液體殘留，適當提高離心速度，再離心