SNP檢測方法講課版ppt課件

1、SNPs的檢測方法 唐敏2005.8.12主要內(nèi)容nSNPs的定義nSNPs的研討意義nSNPs的研討進(jìn)展和方向nSNPs的檢測方法SNPs的定義定義：單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因組程度上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 (99.9%)SNPs的研討意義1. SNPs作為第三代遺傳標(biāo)志知性、可遺傳性、可檢測性，用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。_路標(biāo)的作用傳統(tǒng)研討戰(zhàn)略表征、蛋白、基因逆向遺傳學(xué)表型、基因、蛋白，2.基因多態(tài)性研討 研討SNPs本身對(duì)機(jī)體的影響生理特征、病理?xiàng)l件下的千差萬別 SNPs研討

2、進(jìn)展和方向1. SNPs數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)2. SNPs功能的研討在1的根底上SNPs檢測方法1.理想的檢測SNPs的方法 發(fā)現(xiàn)未知的SNPs，或檢測知的SNPs(1) 靈敏度和準(zhǔn)確度的要求反響原理嚴(yán)緊(2) 快速、簡便、高通量 (操作和分析的自動(dòng)化程度高 (3) 費(fèi)用相對(duì)低廉2.現(xiàn)狀： 到如今還沒有一個(gè)符合以上條件的理想方法出現(xiàn),但根據(jù)實(shí)踐情況,可以選擇出較適宜方法。3.每種SNPs的檢測方法都可將之看成由 區(qū)分SNPs特異位點(diǎn)的原理方法 和 數(shù)據(jù)的檢測分析手段 兩部分組成。SNPs檢測方法的分類一、區(qū)分一、區(qū)分SNPs 位點(diǎn)的位點(diǎn)的方法方法 1.基于雜交的方法基于雜交的方法 2.基于酶的方法

3、基于酶的方法 3.以構(gòu)象為根底的方法以構(gòu)象為根底的方法 4.直接測序的方法直接測序的方法二、檢測分析技術(shù)二、檢測分析技術(shù) 1.凝膠分析技術(shù)凝膠分析技術(shù) 2.熒光檢測技術(shù)熒光檢測技術(shù) 3. DNA 芯片芯片 4.質(zhì)譜檢測技術(shù)質(zhì)譜檢測技術(shù) 1.基于雜交的方法n原理:n 短的核苷酸探針在和互補(bǔ)的目的片段進(jìn)展雜交時(shí)，完全匹配和有錯(cuò)配兩種情況下，根據(jù)雜交復(fù)合體穩(wěn)定性的不同而將SNPs 位點(diǎn)檢測出來。 差別越大，檢測的特異性就越好1利用Tmn固定溫度n 等位基因特異核苷酸探針 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。n 修飾過的探針：引入一個(gè)錯(cuò)配的堿基、 PNA、

4、LNAs 等n 動(dòng)態(tài)的加熱過程 動(dòng)態(tài)等位基因特異雜交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH) 核酸肽探針Peptide nucleic acids，PNA)n其骨架是肽鍵n特點(diǎn)：n1、與靶分子高特異性地結(jié)合3個(gè)方面的影響n2、鏈擠入 構(gòu)成三鏈復(fù)合構(gòu)造表達(dá)調(diào)控以及反義治療方面n3、對(duì)核酸酶和蛋白酶均不敏感體外運(yùn)用1、與靶分子高特異性地結(jié)合nTm值高n受鹽濃度影響小低鹽濃度的體系nTm更大一個(gè)PNA堿基的錯(cuò)配會(huì)使其Tm值降低8-20度n所以，PNA/DNA的非特異結(jié)合能得到很好的排除。 LNA(locked nucleic acids) n其構(gòu)造

5、是在RNA分子的2羥基和核糖環(huán)的4碳原子間連入一個(gè)亞甲基的“橋。n特點(diǎn)：n 1.能以很高的親和性和互補(bǔ)的DNA、RNA 或LNA 結(jié)合構(gòu)象更利于雜交的穩(wěn)定n 2.匹配和不匹配的Tm添加DASH(dynamic allele-specific hybridization2雜交+熒光共振分子信標(biāo)雙分子間雜交 蝎狀探針分子內(nèi)雜交分子信標(biāo)Molecular beacons蝎狀探針 Scorpion primer 2.基于酶的方法1DNA聚合酶2銜接酶3限制性內(nèi)切酶4外切酶FEN5RNase H1DNA聚合酶n等位基因特異性PCRn多重等位基因特異性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸測序法等位基

6、因特異性PCRTaqman 法微測序法/引物延伸法根本步驟液相1.設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增含SNPs位點(diǎn)的一段DNA2.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)展純化去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸產(chǎn)物檢測 放射性同位素標(biāo)志法、發(fā)光檢測法、凝膠為根底的熒光檢測法、 質(zhì)譜分析法、變性高壓液相色譜法等APEX (arrayed primer extension)固相焦磷酸測序法(Pyrosequencing )nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、熒光素酶(luciferase) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶( apyrase) 。n原理：DNA 聚合酶在一種dNTP的存在下進(jìn)展引物延伸反響,而引物

7、的勝利延伸將伴隨焦磷酸的釋放,焦磷酸在熒光素酶的存在下能引一種發(fā)化學(xué)發(fā)光反響,經(jīng)過發(fā)光計(jì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測來到達(dá)檢測的目的。根本步驟1. 1.測序引物和測序引物和DNADNA模板雜交模板雜交PCRPCR擴(kuò)增的、單鏈的，與擴(kuò)增的、單鏈的，與酶和底物孵育。酶和底物孵育。2.2.四種四種dNTPdNTPdATPSdATPS，dTTPdTTP，dCTPdCTP，dGTPdGTP之一被參之一被參與反響體系，如與模板配對(duì)，與引物的末端構(gòu)成共價(jià)與反響體系，如與模板配對(duì)，與引物的末端構(gòu)成共價(jià)鍵，鍵，dNTPdNTP的焦磷酸基團(tuán)的焦磷酸基團(tuán)PPiPPi釋放出來。釋放出來。3.3.一系列的酶學(xué)反響，發(fā)出可見光信號(hào)。每個(gè)光信號(hào)的一系列的酶學(xué)反響，發(fā)出可見光信號(hào)。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反響中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。峰高與反響中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。4. ATP4. ATP和未摻入的和未摻入的dNTPdNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反響體系。滅光信號(hào)，并再生反響體系。5.5.然后參與下一