紫杉醇的提取工藝研究

1、紫杉醇提取純化方法的研究進展紫杉醇是最早從紅豆杉屬植物中分離出來的三環(huán)二菇類化合物，是繼阿霉素和順鉑之后最熱點的抗癌新藥。紫杉醇具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分子由3個主環(huán)構(gòu)成二菇核，分子中有11個手性中心和多個取代基團，母環(huán)部分是一個復(fù)雜的四環(huán)體系，有許多功能基團和立體化學(xué)特征。分子式C47H51NO14，分子量853.92。同位素示蹤表明, 紫杉醇只結(jié)合到聚合的微管上, 不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。細胞接觸紫杉醇后會在細胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細胞的各種功能,特別是使細胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細胞的正常分裂。 通過-臨床研究，紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、

2、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。紫杉醇屬于有絲分裂抑制劑,它的獨特機制在于可以誘導(dǎo)和促進微管蛋白聚合,促進微管裝配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌細胞紡錘體的形成,阻止有絲分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,從而起到抗癌的作用。迄今為止紫杉醇是唯一促進微管聚合的新型抗癌藥。這一新的發(fā)現(xiàn)引起了各國醫(yī)藥界的極大興趣?，F(xiàn)在已有包括我國在內(nèi)的十多個國家批準了紫杉醇類藥物的正式生產(chǎn)。目前有關(guān)紫杉醇研究的幾個主要問題是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的臨床應(yīng)用(水不溶性問題的解決);紫杉醇的構(gòu)效關(guān)系;紫杉醇的抗癌機理。紫杉醇的抗癌機理1971年,Wani等報道了紫杉醇在一些

3、實驗體系中具有抗癌活性。1978年,Schiff等發(fā)現(xiàn)紫杉醇在極低的濃度下(0.25M)可以完全抑制Hela細胞的分裂,而且在對細胞4小時的培養(yǎng)過程中,對DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成沒有明顯影響。Hela細胞在與紫杉醇共同溫育20小時后被阻斷在G2后期和M期。1979年Schiff等用濁度法進行了研究,發(fā)現(xiàn)紫杉醇能縮短微管在體外的聚合時間,使平衡向微管聚合方向移動,從而減小微管聚合臨界濃度。在有GTP時,紫杉醇可以和PC-tubulin結(jié)合,計量比為1:1。他們還發(fā)現(xiàn)紫杉醇不影響純化的Actin的聚合(紫杉醇20M)。目前,有關(guān)紫杉醇的抗癌機理的研究仍是一個非?；钴S的領(lǐng)域。最近的一些進展是Ta

4、tebe等發(fā)現(xiàn)紫杉醇能導(dǎo)致細胞凋亡;Kavallaris等首次報道了紫杉醇抑制卵巢上皮腫瘤與改變特定-tubulin基因的表達有關(guān);Vater等通過電鏡和掃描力顯微鏡發(fā)現(xiàn)在Ca2+和紫杉醇存在下,微管蛋白的聚合發(fā)生畸變Dring等發(fā)現(xiàn)紫杉醇還可調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能，促進釋放腫瘤壞死因子、白細胞介素、以及干擾素，對腫瘤細胞起抑制或殺傷作用。而且這種畸變結(jié)構(gòu)隨著加入紫杉醇和Ca2+的順序不同而有所不同。紫杉醇的來源1963年美國化學(xué)家瓦尼(M·C·Wani)和沃爾(MonreE·Wall)首次從一種生長在美國西部大森林中的短葉紅豆杉樹皮和木材中得到了紫杉醇的粗提物并發(fā)現(xiàn)其

5、具有抗癌活性。但直到1969年,紫杉醇單體才被分離出來。此后,在紅豆杉屬的多種植物中均發(fā)現(xiàn)有紫杉醇存在。紅豆杉屬植物為紅豆杉科常綠喬木或灌木,全世界共11種,分布于北半球的溫帶至亞熱帶地區(qū),包括短葉紅豆杉(Taxus brevifolia),歐洲紅豆杉(T. baccata),云南紅豆杉(T.yun-nanensis),中國紅豆杉(T. chinensis)等。在歐洲,更為常見的是歐洲紅豆杉(Taxus baccata),具有明顯的毒性,常有牲畜和人誤食中毒的事情發(fā)生,其毒性源于所含有的有毒生物堿紫杉堿(taxineA、B);因而后來有一個有趣的觀點:如果當年在NCI抗癌活性成分篩選計劃中沃爾

6、和瓦尼拿到的是T.baccata而非T.brevifolia的樹皮,要么會因萃取物的毒性而停止分離,要么只能得到紫杉堿,都不會有機會發(fā)現(xiàn)Taxol。幸運的是,美國農(nóng)業(yè)部的收集計劃中送來的唯一樣品是T.brevifolia,而其中紫杉堿的含量極微,紫杉醇從而有幸成為30年來最為公眾矚目的植物來源的化合物。迄今為止,紅豆杉屬植物仍是紫杉醇的最重要的來源。除了可從其樹皮和枝葉中直接分離得到紫杉醇外,其樹葉中含量很高的10-去乙酰巴卡亭III也是人工半合成紫杉醇的原料。此外,紫杉醇還可以從全人工合成、真菌發(fā)酵、細胞培養(yǎng)及生物合成等途徑獲得。紫杉醇提取工藝 隨著人們對紫杉醇研究的不斷深入和完善，化學(xué)合成

7、、基因工程、細胞培養(yǎng)、真菌發(fā)酵等方法均可以成功獲得紫杉醇，但這些方法應(yīng)用于紫杉醇的生產(chǎn)依舊停留在實驗室研究階段。目前，國內(nèi)外紫杉醇的商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)多以紅豆杉植物為原料，通過一系列的分離純化獲得。針對紅豆杉資源嚴重匾乏的現(xiàn)狀，相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)采用人工培植的方法經(jīng)過科學(xué)合理的選種育種栽培，加大紅豆杉植物的人工培植規(guī)模，為紫杉醇的生產(chǎn)提供相對充足的原料供給。在細胞組織培養(yǎng)和基因工程技術(shù)等方法應(yīng)用到紫杉醇的工業(yè)化生產(chǎn)之前，植物提取法仍是紫杉醇的主要來源。因此，開發(fā)出一套操作簡便、快速高效的紫杉醇提取分離純化技術(shù)無疑對紫杉醇原料藥的產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀發(fā)揮積極作用。紫杉醇的提取過程可分為粗提和純化兩個階段。紅豆杉植物經(jīng)

8、粉碎干燥等預(yù)處理后，進入紫杉醇的粗提工藝程序。粗提階段的目的在于選擇合適的提取溶劑，運用可行的提取手段對原料粉末進行提取處理，獲得含目標產(chǎn)物的原料液，然后從原料液中盡可能多的提取目標產(chǎn)物，提高目標產(chǎn)物在物料中的含量，所得物料在進行后續(xù)純化獲得純品。紫杉醇的粗提工藝過程可分為初級提取和次級提取，兩個過程因所用溶劑不同而除去不同的雜質(zhì)。1、紫杉醇的初級提取工藝初級提取主要是用甲醇、乙醇、乙酸乙酷一丙酮或二氯乙烷一水對原料粉末進行浸提，一般浸提時間較長。為了縮短浸提時間，研究人員將超聲、微波和超臨界流體萃取等技術(shù)引入到紫杉醇的初級萃取，極大提高了紫杉醇的萃取效率。1.1溶劑浸提溶劑浸提常用于紫杉醇的

9、粗提階段，在此階段主要考慮溶劑的選擇。目前用于浸提紫杉醇的最普通溶劑是甲醇、乙醇等有機溶劑。xu和Liu采用的是甲醇-二氯甲烷(95:5，V/V)混合物，浸提時間為3560min，而Hoke，和Powell，都選擇的是純甲醇，浸提時間則為1648h。余廣鰲等通過研究發(fā)現(xiàn)，在浸提過程中，如果使用單一溶劑，則甲醇浸提效果最好。如果使用混合溶劑，要達到好的浸提效果，甲醇或乙醇等高極性有機溶劑不可缺少。鍋田憲助等對于紫杉醇的提取溶劑種類進行了詳細研究，結(jié)果表明:在乙酸乙酷、乙醚等溶劑中，以乙酸乙醋一丙酮(1:1)混和溶劑的提取效果最好，浸膏中紫杉醇的含量高達0.084%，是甲醇提取所得浸膏中紫杉醇含量

10、的3倍。也就是說用乙酸乙酷一丙酮(1:1，v/v)一次便可以使紫杉醇提取量高于以往常用溶劑所能得到的量，為后序的分離純化工作帶來很大的方便。加之乙酸乙酷一丙酮(1:l)與甲醇成本相當，因此，這一提取方法的經(jīng)濟性和實用性較強。1.2超聲浸提在中草藥開發(fā)利用中，探索提高有效成分提取率的理論依據(jù)是中草藥現(xiàn)代化研究的一個重要方面。目前大多數(shù)是通過實驗方法，根據(jù)影響提取率的因素選取不同的水平條件來設(shè)計實驗，優(yōu)化工藝條件，缺少理論上的指導(dǎo)。有人將這些影響因素與有效成分溶出濃度聯(lián)系起來，在FICk擴散定律的基礎(chǔ)上對常規(guī)提取的動力學(xué)建立了一些數(shù)學(xué)模型。由于超聲場強化中藥有效成分的提取具有降低提取溫度、縮短時間

11、和提高提取率等優(yōu)點，日益受到人們的重視。超聲強化提取的湍流效應(yīng)、微擾效應(yīng)、界面效應(yīng)和聚能效應(yīng)與超聲場的頻率、功率及體系的溫度有關(guān)。頻率越高，溫度越高，這四種效應(yīng)作用越強，達到提取平衡時間越短，平衡時有效成分含量越高;同時在中藥有效成分提取時，要考慮到有效成分的穩(wěn)定性，避免在高溫和長時間條件下有效成分的分解。Auriola等人也將超聲技術(shù)引入紫杉醇的初級萃取，研究發(fā)現(xiàn)采用超聲技術(shù)，可在低溫下進行操作，這樣可以防止紫杉醇在溫度高時可能發(fā)生的異構(gòu)化。1.3超臨界流體萃取超臨界流體萃取過程是利用處于臨界低壓和臨界溫度以上的流體具有特異增加的溶解能力而發(fā)展出來的化工分離新技術(shù)。利用CO2超臨界流體,加入

12、甲醇或乙醇作為夾帶劑,可使紅豆杉樹皮中的大部分紫杉醇得到有效提取,回收率達85%,選擇性好,雜質(zhì)少。超臨界流體萃取具有提取能力強、提取率高、萃取時間短、工藝簡單、操作方便、產(chǎn)品質(zhì)量好的優(yōu)點;同時符合環(huán)保要求，與回歸大自然，崇尚綠色工業(yè)的潮流一致，具有較大的發(fā)展前景。在紫杉醇的提取過程中，由于減少了含氯有機溶劑的使用從而避免了對環(huán)境的污染。超臨界流體萃取過程中最常用的溶劑是CO2，本身無毒，在提取產(chǎn)物中無殘留，因而從用要安全角度來講，該技術(shù)應(yīng)用于紫杉醇的提取具有其獨特的優(yōu)點。Jennings用CO2和加入乙醇改性劑的CO2作超臨界萃取溶劑，在318K的溫度下和15.0725.79MPa的壓力下，

13、進行了紫杉醇的提取研究，發(fā)現(xiàn)紅豆杉樹皮中的大部分紫杉醇都能得到有效的提取，而且對紫杉醇的選擇性要比傳統(tǒng)的單純乙醇提取高; Nair等用含15%的丙酮或乙醇的CO2作溶劑，在430101.325kpa，308K下用超臨界技術(shù)提取紫杉醇也獲得了滿意的效果; Castor等以紅豆杉枝葉和嫩芽做原料，用超臨界技術(shù)提取紫杉醇時，先以純CO2做溶劑，以除去原料中的脂類，然后加入乙醇以調(diào)節(jié)溶劑的極性，使紫杉醇的產(chǎn)率達到了0.04%;Vandana等利用超臨界的N2O和N2O/EtOH混合物，對短葉紅豆杉樹皮中的紫杉醇也做了提取研究，發(fā)現(xiàn)利用超臨界的N2O，以乙醇為夾帶劑，可以把樹皮中的大部分紫杉醇提取出來，

14、比以乙醇為夾帶劑的超臨界CO2萃取更加有效。雖然超臨界流體萃取技術(shù)在紫杉醇的提取中具有收率高、節(jié)省時間和有機溶劑等優(yōu)點，但該方法對儀器設(shè)備要求較高，限制了其應(yīng)用。1.4微波提取微波是一種波長在10.001m、頻率在300MHZ300GHZ的電磁波。由于其具有獨特的性質(zhì)(似光特性、穿透特性、熱特性及生物效應(yīng))而已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。在中草藥有效成分的提取中亦有嘗試和應(yīng)用，但尚未在規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用。微波提取技術(shù)主要是基于微波的熱特性，其加熱原理是利用微波場中介質(zhì)的偶極子轉(zhuǎn)向極化與界面極化的時間與微波頻率吻合的特點，促使介質(zhì)轉(zhuǎn)動能級躍遷，加劇熱運動，將電能轉(zhuǎn)化為熱能。微波輻射導(dǎo)致細胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其

15、是水分子吸收微波能量而產(chǎn)生大量的熱量，使細胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細胞壁和細胞膜沖破，形成微小的孔洞。進一步加熱，細胞內(nèi)部和細胞壁水分減少，細胞收縮，表面出現(xiàn)裂隙。因此使胞外溶劑容易進人胞內(nèi)，溶解并釋放出有效成分。與傳統(tǒng)浸提方法相比，微波提取具有穿透力強、選擇性高、加熱效率高等顯著特點，而且其操作簡便、快速、節(jié)能、高效。因此，微波技術(shù)用于中草藥有效成分提取具有巨大潛力。Kas1tu等采用甲醇或乙醇作為提取溶劑，在60條件下對紅豆杉植物進行提取，所需時間長達2448h，在溶劑系統(tǒng)不變的情況下，采用微波技術(shù)，提取時間縮短到10min以內(nèi)。2、紫杉醇的次級提取工藝初級提取得到的原料液

16、中，紫杉醇的濃度很低，需經(jīng)進一步萃取分離以獲得符合純化標準的紫杉醇浸膏。次級提取中最為常用的方法為液液萃取，此外還有固相萃取和膜分離等。2.1液液萃取液液萃取通常分為非極性溶劑萃取、低極性溶劑萃取和堿液洗滌。對紅豆杉植物進行浸提后，所獲浸膏通常用非極性或低極性溶劑進行分配萃取。通常是用二氯甲烷一水或三氯甲烷一水對上述浸膏進行分配萃取。這種方法簡單易行，但所得產(chǎn)物雜質(zhì)較多。wall等對短葉紅豆杉樹皮的乙醇提取物用水和三氯甲烷進行分配萃取，效果較為理想;Witherup等對6種紅豆杉屬植物的針葉和樹皮進行了分析，主要用二氯甲烷和水對提取物進行分配，溶于二氯甲烷的部分用多種溶劑抽提，來進行初分離。這

17、種低極性溶劑萃取方法的局限是過程中伴隨紫杉醇的較大損失，因為體系中含有相當量的極性較高的溶劑如甲醇、乙醇等，在除去的雜質(zhì)相中仍有大量的紫杉醇，且此方法需反復(fù)多次操作，有機溶劑消耗量大，易造成污染環(huán)境。為了改善上述缺點，元英進等闊用乙酸乙醋溶解紫杉醇浸膏后，再以堿溶液進行洗滌，除去大量雜質(zhì)的同時使紫杉醇幾乎全部回收，此方法節(jié)約了溶劑用量，并減少了環(huán)境污染，可用于生產(chǎn)。EP5533780A提出了一種分離紫杉醇及其前體的方法，包括真空干燥紫杉屬植物的甲醇萃取物，用環(huán)己烷和二氯甲烷進行溶劑萃取以得到粗紫杉醇，接著進行硅膠柱HPLC分離等步驟;w094-13827提出了一種純化紫杉醇的方法，包括用乙醇、

18、甲醇和丙酮進行有機溶劑萃取，用活性炭或木炭作吸附劑進一步處理粗提物，接著用正相色譜法分離。Enakasha等人在分離紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)物時采用的次級萃取劑是氯仿。實驗時首先將愈傷組織用甲醇萃取，勻漿化。過濾后將濾液調(diào)整為甲醇含量為65%，加入氯仿(3:1，v/v)，分相，最終紫杉醇回收率為87%。2.2固相萃取由于植物中紫杉醉含量很低，且成分復(fù)雜，提取工作困難，液一液萃取操作又常導(dǎo)致回收率低、分離效果差等問題。固相萃取法(Solid一 PhaseExtraction，SPE)作為一種新型萃取方法，具有節(jié)省時間、降低溶劑用量、提高選擇性和收率的優(yōu)點。SPE實質(zhì)是色譜分離方法(前沿色譜)，其主要是

19、除去與紫杉醇極性相差較大的雜質(zhì)。所用填料主要有硅膠、氧化鋁和CIS反相硅膠。固相萃取法所使用的設(shè)備主要是濾筒，通常的做法是將含有紫杉烷類物質(zhì)的原料加入濾筒，進行梯度洗脫。這種方法在完成液一液萃取所能達到的效果的同時還能從一定程度上達到初次色譜分離的效果。陳振德等以紅豆杉科框?qū)僦参?Torreya)的假種皮為原料，直接對乙醇提取物進行硅膠柱層析，降低了制備紫杉醇的成本，擴大了其原料的來源，且保護了植物資源。Mattina等劉在研究中比較了三種不同的固相萃取方法。在第一種方法中使用了高效C18萃取柱作為濾筒;第二種方法將C18吸附劑裝入聚丙烯過濾柱制成濾簡;第三種方法中使用的設(shè)備是C18EmP0r

20、e濾板和Millipore玻璃過濾儀器。無論使用何種裝置進行萃取，洗脫液的順序如下:去離子水:20%的甲醉溶液:45%或50%的甲醇溶液:80%的甲醇溶液。大多數(shù)紫杉烷類物質(zhì)都選擇性地被80%的甲醇溶液洗脫下來。最后的比較結(jié)果顯示，C18EmPore濾板能極大地提高粗提物的處理量，同時還能較好地回收極性較低的紫杉烷類物質(zhì)。韓麗萍等選擇中性氧化鋁進行固相萃取，有效的去除了紫杉浸膏和紫杉口服液制劑中的雜質(zhì)和干擾物，使其中的待測成份紫杉醇得到了準確有效的定量分析。2.3膜分離技術(shù)膜分離(MembraneS即 aration)是利用具有一定選擇性、透過特性的過濾介質(zhì)進行物質(zhì)的分離純化，是人類最早應(yīng)用的

21、分離技術(shù)之一。作為一種有效的分離純化手段，膜分離被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。它依靠膜兩側(cè)的壓力差，在與溶液接觸時，使溶液中分子量小于其截留分子量的溶質(zhì)透過膜，分子量大于截留分子量的溶質(zhì)留在原液內(nèi)，通過對試樣中物質(zhì)分子量的不同，選擇截留分子量不同的膜分離設(shè)備達到對物料中組分的分離。膜分離法近年來也用于分離紫杉烷類化合物。Carver等采用平板式、中空纖維式和管式膜組件，對超濾膜和反滲透膜在紫杉烷類物質(zhì)的分離過程中的應(yīng)用進行了研究，其結(jié)果表明:采用膜分離方法可以進一步濃縮粗提過程所得浸膏，使紫杉烷類物質(zhì)的濃度提高5倍左右，相當于對浸膏又進行了一次預(yù)處理，從而減小了后序色譜分離的負擔(dān)和紫杉醇

22、的損失。Raymond等人用0.2m的尼龍膜和PVDF膜處理紫杉醇的組織培養(yǎng)液時，發(fā)現(xiàn)尼龍膜可以選擇性地截留紫杉烷類物質(zhì)。尼龍膜截留了幾乎所有的10-去乙酞基紫杉醇、紫杉醇以及絕大部分的Cephal。mannine，而對其它的紫杉烷類幾乎沒有截留作用，而PVDF膜則截留了所有的紫杉烷類，這說明尼龍膜可以選擇性地吸附紫杉烷類化合物。2.4樹脂吸附分離法樹脂吸附分離法 (ResiouSAdsorpti。 nSeparati。 nMethod，RASM)基于離子交換分離原理。離子交換分離的原理是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進行物質(zhì)分離的技術(shù)。最常用的離子交換劑是離子交換樹脂，它

23、是由不溶性的載體、功能團和平衡離子(也稱活性離子)組成的。紫杉醇是一種二菇類化合物，具有多環(huán)結(jié)構(gòu)，容易被帶苯環(huán)的吸附劑特異性吸附，所以近年聚苯乙烯型樹脂被較多的應(yīng)用到紫杉醇的前處理中，可有效的去除色素等雜質(zhì)。元英進等的研究結(jié)果表明，聚苯乙烯型強堿樹脂(Ps-A)及多乙烯多胺一環(huán)氧氯丙烷縮聚型弱堿樹脂(PC-A)對二氯甲烷粗提物的吸附及脫色性能較好，有望用于紫杉醇的純化分離。張志強等采用聚苯乙烯型大孔樹脂 (201x4)層析，有效地從紅豆杉甲醇浸膏中分離紫杉醇和脫除色素，樣品中紫杉醇含量從0.65%提高到了2.15%，回收率達99.6%。以上各種方法得到的是低純度的紫杉醇浸膏，實際上是紫杉烷類化

24、合物如菇類化合物、類脂、葉綠素和酚類同時伴隨有目標產(chǎn)物紫杉醇，要得到藥用的紫杉醇，還需進一步純化和精制。3、紫杉醇的純化工藝經(jīng)過粗提獲得的浸膏中紫杉醇的含量很低，要獲得達到醫(yī)用純度的紫杉醇還需對粗提物進一步純化處理。紫杉醇的純化工藝是獲得高純紫杉醇的關(guān)鍵步驟，這一步驟涉及的工藝占主導(dǎo)地位的是色譜方法。用色譜法分離純化紫杉醇時，柱色譜被用于紫杉醇的預(yù)分離和最終分離，而薄層色譜則被用于紫杉醇的檢測和純化。目前，隨著分離工藝的不斷完善，色譜法有了長足進步。各種用于紫杉醇分離純化的色譜方法有高效液相色譜(HPLC)，薄層色譜(TLC)，超臨界流體色譜(SFC)、電泳色譜(MEKC)、免疫親和色譜、高效

25、逆流色譜(HSCCC)等。下面簡單介紹幾種常用的紫杉醇純化方法。3.1正相色譜法正相色譜是紫杉醇分離純化過程中普遍采用的方法，在早期分離純化的研究中占有主導(dǎo)地位，至今仍在廣泛使用。正相色譜一般是使用硅膠作固定相，使用一些極性較小的有機溶劑作流動相，將紫杉烷類化合物洗脫出來。正相色譜的突出優(yōu)點是固定相價格低廉，用普通的硅膠即可，而且洗脫用的流動相多為揮發(fā)性很強的有機溶劑，溶劑回收簡單。陳建民等以50一300目硅膠做固定相，在常壓下梯度洗脫含10.48%的紫杉醇粗品，用無毒性的正構(gòu)烷烴、乙酷為洗脫劑，常壓下分離純化紫杉醇，洗脫所得餾分經(jīng)真空冷凍干燥，得到99十99.5%的紫杉醇。該方法工藝簡單，成

26、本低，洗脫劑容易回收，但紫杉醇回收率較低;呂秀陽等將樣品進行浸提和液液萃取后，使用了三次正相色譜分離，在三次柱層析的過程中，采用的空白硅膠目數(shù)增加，空白硅膠與拌樣硅膠之比增大，而流動相的極性下降，最后結(jié)晶得到紫杉醇含量62.5%的白色棉花狀結(jié)晶。3.2反相色譜法由于正相色譜所使用的固定相大多為硅膠，而硅膠的不可逆吸附使樣品損失增大，并且硅膠固定相只能使用一次，操作十分不便，因而反相色譜的使用越來越廣泛。一般情況下，反相色譜使用極性較大的有機溶劑作為流動相，先將一些雜質(zhì)及色素洗脫下來，然后再增大梯度將紫杉烷類化合物洗脫出來。雛麗娜等以東北紅豆杉樹葉為原料，采用正相色譜和反相色譜法分離提純了紫杉醇

27、和三尖杉寧堿，反相色譜中使用了一種新穎的高分子填料。東北紅豆杉枝葉經(jīng)過一次正相色譜分離后，再經(jīng)兩次反相色譜分離，分離得到兩種白色針狀固體。經(jīng)1H NMR和13C NMR測試表明，兩種物質(zhì)分別為紫杉醇和三尖杉寧堿，純度達到98%以上，回收率大于70%;張志強等選擇了廉價的大顆粒烷基硅膠層析柱純化紫杉醇粗品，并對層析操作條件進行了優(yōu)化，使紫杉醇的含量提高到98%，回收率在85%以上，并且采用該固定相可以降低紫杉醇的生產(chǎn)成本和提高回收率;Zamir等人在分離加拿大紅豆杉的根和樹皮時，使用了重結(jié)晶技術(shù)和反向色譜技術(shù)相結(jié)合的方法。他們首先利用重結(jié)晶技術(shù)從粗提物中分離出了10-DAB和9-dihydro-

28、13acetyl-baCCatinlll，再用反相高效液相色譜分離其他紫杉烷類物質(zhì)，從而避免了在分離純化階段多次使用色譜柱，。雖然目前反相色譜分離純化紫杉醇的工藝尚沒有工業(yè)化的報道，但相對于正相色譜工藝，反相色譜有很多優(yōu)點。首先，它不消耗大量的有機溶劑，對環(huán)境污染較小;其次，人們在開發(fā)反相填料時專門引入的一些特定的鍵合相使反相填料有更好的選擇性，在克服正相硅膠的不可逆吸附造成目標產(chǎn)物回收率低方面也很有價值。3.3薄層色譜法薄層色譜(TLC)是分離紫杉醇的常用方法。一般先把提取液濃縮，然后在TLC硅膠板上平行點樣，用丙酮、氯仿、甲醇、庚烷、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙醋等展開，再進行紫杉醇的定位。定位

29、的方法有:與標準樣進行對照，在254nm紫外燈下進行定位標記，刮下每一部位，裝入小柱。用甲醇洗脫，將洗脫液蒸干，從而使紫杉醇得到分離。薄層色譜技術(shù)早期多用于紫杉烷類化合物的定性及半定量分析。TLC結(jié)合核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)技術(shù)，己成功地分離獲得多種新的紫杉烷類化合物，顯示出在定性分析方面的優(yōu)勢。Matysik等報道了一種分步梯度TLC結(jié)合光密度掃描定量測定紫杉醇的方法，該方法采用混合溶劑兩步梯度展開，亦獲得滿意結(jié)果;由Stasko等人開發(fā)的多維薄層色譜法(MTLC)使TLC法獲得了極大的發(fā)展。該項研究采用了三種薄層板:氰基板，二苯基板和氨基板，分別進行正相和兩維洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氰基板和二苯基板能有效分離紫杉醇和Cephalomafinine，而氨基板效果較差。雖然