共聚焦操作流程

1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境觀察儀器是否有外表明顯損壞，如需開啟空調(diào)，一般控制在25度。拉上窗簾，避免標(biāo)本熒光淬滅及雜光干擾。開機(jī)查看實(shí)驗(yàn)記錄，確認(rèn)是否馬上能開機(jī)（注意：汞燈必須在關(guān)機(jī)20分鐘以后才能再開啟,般為30分鐘）。確認(rèn)后可執(zhí)行以下操作：（務(wù)必先開電源，后開鑰匙！!）01、打開PSU（主電源）2、打開激光器（只開啟需使用的激光器）1）、氮離子多線激光器（458/488/515,應(yīng)用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP等）。2） MCPSU半導(dǎo)體綜合激光器（LD405應(yīng)用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635應(yīng)用染料：CY5/Alexa647等）。3） LD55

2、9激光器（注意：電源打開后不要馬上開鑰匙，等待TEMP指示燈不閃爍后，再開鑰匙，紅色指示燈不閃爍后，可正常使用）。3、打開顯微鏡電源IX2-UCB4、打開熒光汞燈（注意：開啟后，“15分鐘內(nèi)勿關(guān)”）UserID:Adminislratw5、打開電腦主機(jī)、顯示器，登陸windowsxp系統(tǒng)d旭皆，雙擊共聚焦軟件User10.月Jniinish若ter,打開FV10-ASW應(yīng)用軟件.，-8打取圖1、DIC（微分干涉差）明場立體圖（1）、插入起偏鏡、檢偏鏡（DIC滑塊）。（2）、FV10-ASW軟件中點(diǎn)擊透射光觀察按鈕打開鹵素?zé)艨扉T，使用TD滑塊（軟件TDlamp項(xiàng)）控制鹵素?zé)舻墓鈴?qiáng)，倒置顯微鏡下觀

3、察標(biāo)本，進(jìn)行標(biāo)本聚焦。1）、使用手控面板選擇合適倍率的物鏡下觀察（注意若用60X油鏡時(shí)，檢偏鏡部位要推上彎桿）,并檢查各物鏡對應(yīng)的DIC元件。2）、可在檢偏鏡部位用旋鈕進(jìn)行對比度的調(diào)節(jié)。（需要時(shí)可使用，一般勿調(diào)）（3）、FV10-ASW軟件中點(diǎn)擊透射光觀察按鈕,關(guān)閉鹵素?zé)艨扉T。打開DIC通道，執(zhí)行取圖操作。1）、調(diào)節(jié)掃描速度至最快（2.0us/pixel）,size為512by,點(diǎn)擊整呵遍,進(jìn)行快速預(yù)掃，尋找焦平面。步驟：適當(dāng)調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù);貫a“以（一般為能看到圖像即可），快速調(diào)尋找焦平面，如需放大光學(xué)倍數(shù)，可適當(dāng)調(diào)節(jié)一。點(diǎn)擊，停止預(yù)掃描。2）、選擇AutoHV,放慢掃

4、描速度（掃描速度越慢，掃描時(shí)間越長，圖像信噪比好，但耗時(shí)，易淬滅，一般為10-12.5us/pixel）,size為640by,點(diǎn)擊燈刖爐或進(jìn)行再預(yù)掃,調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù)至圖象清晰尖銳即可。點(diǎn)擊湍,停止預(yù)掃描。FifteiMode3）、若背景噪音仍過多也可選上KMrm1”來降低隨機(jī)噪音干擾（次數(shù)越多降噪越好，但掃描時(shí)間也越長，一般在HV較高時(shí)使用）。4）、點(diǎn)擊進(jìn)行取圖，并保存。（注意：原始圖像一定要保存為oib格式）朝MoOe5）、去掉乩訕血”，將掃描速度、size恢復(fù)至初始狀態(tài)（掃描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel,size為512by）,為下一個(gè)標(biāo)本做好準(zhǔn)備。

5、2、熒光圖（1）、拉出檢偏鏡（DIC滑塊），打開汞燈機(jī)械快門（shutter）。（2）、FV10-ASW軟件中點(diǎn)擊汞燈觀察按鈕V,打開汞燈快門，倒置顯微鏡下觀察標(biāo)本，進(jìn)行標(biāo)本聚焦（找視野）。使用手控面板，根據(jù)標(biāo)本熒光探針選擇合適的熒光慮色片及選擇合適的物鏡下觀察，WU紫外激發(fā)/藍(lán)色熒光（eg:DAPI）,WB藍(lán)色激發(fā)/綠色熒光（eg:FITC、EGFP）,WG綠色激發(fā)/紅色熒光（eg:TexasRed,Rhodamine,DsRed>（一般要求標(biāo)本在所用的各種熒光探針匹配的熒光慮色片下均能觀察到所需視野，eg:DAPI+FITC+TexasRed多色熒光探針，需在WU,WB,WG下均能觀

6、察到所需視野，DAPI一般熒光較強(qiáng)，F(xiàn)ITC或TexasRed下易找些）。（注意：更換不同倍數(shù)物鏡時(shí)應(yīng)適當(dāng)降低物鏡再更換，以免損壞物鏡；若用60X油鏡時(shí)，要插入檢偏鏡并推上彎桿。）（3）、FV10-ASW軟件中點(diǎn)擊汞光觀察按鈕T,關(guān)閉汞燈快門。執(zhí)行取圖操作。1）、點(diǎn)擊_一,添加熒光染料。（最多為三色，多于三色需分別掃描）若標(biāo)本使用的熒光染料不是染料庫里的染料，可選激發(fā)光及發(fā)射光譜較接近的染料代替，這時(shí)可適當(dāng)調(diào)整2）、調(diào)節(jié)掃描速度至最快（2.0us/pixel）,size為512by,點(diǎn)擊燈刖岫承，進(jìn)行快速預(yù)掃，尋找焦平面。imiI*IT7531步驟：適當(dāng)調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù);如

7、（一般為能看到各通道圖像即可）快速調(diào)節(jié),如需放大光學(xué)倍數(shù)，可適當(dāng)調(diào)節(jié)預(yù)掃描。v Se rnelllldl3）、選上 I* Line皿（雙染以上一定要選上，可避免激發(fā)光用色），選才? AutoHV（AutoHV功能為自動(dòng)匹配掃描速度與HV值，不選易造成圖像出現(xiàn)強(qiáng)度過飽和狀態(tài)），放慢掃描速度（一般為10-12.5 us/pixel）一size為640by,點(diǎn)擊融陋叫 進(jìn)行再預(yù)才g,調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù)至圖象清晰尖銳即可。點(diǎn)擊Slop,停止預(yù)掃描。4）、若背景噪音仍過多也可選上Filter Mod, KdlllMII來降低隨機(jī)噪音干擾（次數(shù)越多降噪越好，但掃描時(shí)間也越長，一般在HV較

8、高時(shí)使用）。5）、點(diǎn)擊K尸進(jìn)行取圖，保存及相關(guān)圖像處理。（注意：原始圖像一定要保存為oib格式）FillerMode6）、去掉心加卜血，將掃描速度、size恢復(fù)至初始狀態(tài)（掃描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel,size為512by）,為下一個(gè)標(biāo)本做好取圖準(zhǔn)備。四、刻錄數(shù)據(jù)圖像保存后，退出FV10-ASW軟件，刻錄數(shù)據(jù)（注意：必須用新的光盤，嚴(yán)禁使用U盤、移到硬盤等）五、關(guān)機(jī)務(wù)必先關(guān)鑰匙后關(guān)電源！1、關(guān)閉熒光汞燈（注意：開啟后，“15分鐘內(nèi)勿關(guān)”）2、關(guān)閉激光器1）、關(guān)閉LD559激光器2）、關(guān)閉MCPSU半導(dǎo)體綜合激光器3）、氮離子多線激光器（注意：先關(guān)鑰匙，千萬別馬上關(guān)閉電源，要等風(fēng)扇停止轉(zhuǎn)動(dòng)后再關(guān)閉電源）3、使用擦鏡紙沾擦顯微鏡物鏡（注意：一般物鏡清洗液為乙醇，擦鏡紙為普通擦鏡