玉米籽粒穗軸花色苷含量兩個顯性基因的上位性研究與葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位畢業(yè)論文

1、單位代碼 10635 學(xué) 號 0784碩碩士士學(xué)學(xué)位位論論文文玉米籽粒、穗軸花色苷含量兩個顯性基因的玉米籽粒、穗軸花色苷含量兩個顯性基因的上位性研究與玉米葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定上位性研究與玉米葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位位論文 袁文娟指導(dǎo)教師： 蔡一林 教授學(xué)科專業(yè)： 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向： 玉米分子育種提交論文日期：2013 年 4 月 10 日論文答辯日期：2013 年 6 月 1 日學(xué)位授予單位：西南大學(xué)中 國 重 慶i / 552013 年 6 月獨(dú)獨(dú)創(chuàng)創(chuàng)性性聲聲明明學(xué)位論文題目玉米籽粒、穗軸花色苷含量兩個顯性基因上位性研究與玉米葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位 本人提交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師

2、指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作與取得的研究成果。論文中引用他人已經(jīng)發(fā)表或出版過的研究成果，文中已加了特別標(biāo)注。對本研究與學(xué)位論文撰寫曾做出貢獻(xiàn)的老師、朋友、在文中作了明確說明并表示衷心感。學(xué)位論文 簽字日期： 年 月 日學(xué)學(xué)位位論論文文使使用用授授權(quán)權(quán)書書本學(xué)位論文作者完全了解西南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西南大學(xué)研究生院（籌）可以將學(xué)位論文的全部或部分容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。（的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書，本論文：不，期限至 年 月止） 。學(xué)位論文作者簽

3、名： 導(dǎo)師簽名：簽字日期： 年 月 日 簽字日期： 年 月 日i / 55目 錄摘要摘要 I IABSTRACTABSTRACTIIIIII第一章第一章 文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述 1 11.1 數(shù)量性狀的相關(guān)概念 11.2 QTL 定位的原理與方法 21.2.1 定位的原理 21.2.2 定位的方法 213 QTL 定位方法的最新進(jìn)展 41.3.1 QTL 動態(tài)定位 41.3.2 eQTL 定位 41.33 種質(zhì)資源新基因發(fā)掘的 QTL 定位方法 41.3.4 QTL 精細(xì)定位 51.4 花色苷研究進(jìn)展 51.4.1 花色苷研究現(xiàn)狀 51.4.2 花色苷結(jié)構(gòu)和代途徑 61.4.3 花色苷生理功能 71

4、.5 關(guān)于上位性方面的研究進(jìn)展 81.6 玉米葉片相關(guān)性狀定位方面的研究進(jìn)展 9第二章第二章 引言引言 11112.1 研究的目的與意義 112.2 技術(shù)路線 12第三章第三章 玉米籽?；ㄉ蘸績蓚€顯性基因玉米籽粒花色苷含量兩個顯性基因 GE6GE6 和和 GE10GE10 的上位性研究的上位性研究 13133.1 材料與方法 133.1.1 試驗材料 133.1.2 試驗方法 133.2 結(jié)果與分析 173.2.1 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建 173.2.2 QTL 定位 183.2.3 MuS 與 MoS 兩個群體的表型分析 203.2.4 MuS 與 MoS 兩個群體的籽粒和穗軸花色苷含量的方

5、差分析 213.2.5 MuS 與 MoS 兩個群體的 9 種基因型花色苷平均值的多重比較 223.2.6 MuS 與 MoS 兩個群體的 GE6 和 GE10 的上位性效應(yīng)分析 243.3 結(jié)論與討論 253.3.1.對兩個群體 MuS-BC4F3、MoS-BC4F3籽粒和穗軸花色苷含量定位結(jié)果分析 253.3.2 討論 25第四章第四章 玉米葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位玉米葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位 27274.1 材料與方法 274.1.1 材料 27i / 554.1.2 田間試驗 274.1.3 表型測定 274.1.4 基因型的測定 284.1.5 背景恢復(fù)率的計算 284.1.6 引物

6、的設(shè)計 284.1.7 連鎖圖譜的構(gòu)建 284.1.8 QTL 定位方法與效應(yīng)分析 284.2 結(jié)果與分析 294.2.1 葉脈、葉耳近等基因系的構(gòu)建 294.2.2 BC4F3分離群體的表型鑒定 294.2.3 葉脈葉耳顏色相關(guān)的 SSR 引物篩選與新引物的設(shè)計 304.2.4 MuS-BC4F3目標(biāo) QTL 區(qū)段連鎖圖譜構(gòu)建 324.2.5 葉脈葉耳顏色定位結(jié)果的分析 334.3 結(jié)論與討論 334.4 主要創(chuàng)新點(diǎn) 34參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) 3535致致 4343玉米籽粒、穗軸花色苷含量兩個顯性基因的上位性研究與葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位摘摘 要要玉米是世界上種植面積最大的作物之一，黑玉米有高的

7、花色苷含量，是很好的保健品，對人們的身體健康有重要的作用，黑玉米的主要成分是花色苷，花色苷是構(gòu)成植物花瓣、葉片、果實、種子等器官顏色的最主要水溶性色素，是由苷元與葡萄糖以糖苷鍵形式結(jié)合形成的一類廣泛存在于植物體的類黃酮多酚化合物。花色苷有多種保健功能，花色苷最主要的功能是可以清除自由基，具有抗氧化抗衰老的功能。到目前為止關(guān)于玉米上位性方面的研究多為玉米株高、穗位高、單株總?cè)~數(shù)、穗位葉長、穗位葉寬和穗位葉面積之間的上位性研究，還有在玉米出子率進(jìn)行上位性效應(yīng)分析，而對玉米花色苷的上位性研究很少。上位性的研究可以豐富花色苷的遺傳基礎(chǔ),為遺傳改良提供依據(jù)。葉片是植物的重要組成部分，葉脈葉耳是葉片的重要

8、組成部分，對葉片相關(guān)顏色基因的進(jìn)一步定位，為玉米中色素相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考，為玉米中色素的分子標(biāo)記輔助育種與玉米色素相關(guān)基因的克隆與轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。本文利用西南大學(xué)玉米研究所新育種的材料黑玉米自交系SDM，以SDM為父本，以木6，Mo17分別為母本，構(gòu)建兩個回交群體，通過前景選擇和背景選擇獲得兩個近等基因系BC4F3，對控制玉米籽粒和穗軸的花色苷含量兩個主效基因進(jìn)行上位性研究。另外選擇以SDM為父本，木6為母本，通過前景選擇和背景選擇獲得一個遺傳背景一致的近等基因系BC4F3，進(jìn)行葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位，具體研究結(jié)果如下：1.對兩個群體MuS-BC4F3、MoS-BC4F3籽粒和穗軸花色苷含

9、量兩個顯性基因的上位性研究 兩個群體 MuS-BC4F3、MoS-BC4F3的籽?；ㄉ蘸吭诘?6 染色體上都定位到引物 S8 附近，第 10 染色體上都定位到 IDP8526-bnlg1028 附近。兩群體的穗軸花色苷含量第 6 染色體都定位到引物 S8 附近,第 10 染色體定位到區(qū)間 IDP8526-bnlg1028 附近。兩個群體的籽粒定位區(qū)間和穗軸花色苷定位的區(qū)間都一樣，可見籽?；ㄉ崭叩乃胼S花色苷含量也高，二者有一致性。MuS-BC4F3、MoS-BC4F3兩個群體的基因型確定通過定位結(jié)果的最近標(biāo)記的帶型進(jìn)行確定，最后得出基因型個數(shù)的分離比符合孟德爾的遺傳定律 9：3：3：1，說

10、明籽粒和穗軸花色苷的含量基因主要是受這兩個非等位基因控制的。通過兩個群體的籽粒和穗軸花色苷含量的方差分析發(fā)現(xiàn)不同基因型間玉米籽粒與穗軸花色苷平均含量差異顯著，基因型不同籽粒與穗軸花色苷的平均含量也不同。兩個群體的 9 種基因型花色苷平均值的多重比較表明，AaBb AABb AaBB AABB 四種基因型花色苷含量間差異不顯著，這四種基因型的花色苷含量與 aaBb Aabb aaBB AAbb aabb 五種基因型花色苷含量差異顯著，aaBb Aabb aaBB AAbb aabb 五種基因型I / 55花色苷含量差異不顯著。可見當(dāng)兩個基因同時存在時對花色苷含量影響比較大，只有一個基因作用時對花

11、色苷的影響無明顯差異。兩個群體的籽粒和穗軸花色苷含量的兩個基因上位性分析表明：一個基因單獨(dú)作用時對籽粒和穗軸花色苷的影響都比較低，兩個基因互作時對花色苷的影響比較大?？梢娀蚧プ鲗ㄉ蘸康奶岣哂泻艽蟮淖饔谩?.對群體 MuS-BC4F3葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位MuS-BC4F3群體表型鑒定表明，葉脈和葉耳的非紫色與紫色兩種表型都 1:3，符合孟德爾單基因分離比例 1:3，說明可以排除其它基因的干擾，是對目標(biāo)區(qū)段基因定位的理想材料。根據(jù) F2 代和 BC4F2 的定位結(jié)果。加大葉脈葉耳基因附近引物的篩選力度，通過電泳篩選BC4F3 有差異的引物只有 3 對。為了定位的結(jié)果更準(zhǔn)確需要多設(shè)計引物

12、。在葉脈定位的區(qū)間IDP8526-bnlg1028 和葉耳定位的區(qū)間 IDP8526-bnlg1028 由于葉脈葉耳都定位到一樣的區(qū)間，所以設(shè)計的引物只要有差異在葉脈和葉耳上都可以用來定位，在 NCBI blastn 得知 IDP8526的 BAC 值 AC194430.3 ,bnlg1028 的 BAC 值為 AC205908.3，從 得知IDP8526-bnlg1028 之間的物理距離為 2,753,143bp,物理距離太大，需要通過設(shè)計新的引物來縮短物理距離。利用 SSRHUNTER 逐個尋找 SSR 位點(diǎn)，找到單拷貝的 SSR 位點(diǎn)，用 premie

13、r 5.0 設(shè)計引物，總共設(shè)計了 25 對引物，通過篩選發(fā)現(xiàn)引物 J34 在 SDM 與木 6 之間多態(tài)性比較好。用篩選出來的差異引物和新設(shè)計的引物對葉脈葉耳顏色進(jìn)一步定位，最后葉脈葉耳都定位到區(qū)間 J34-bnlg1028，物理距離為 1304kb，極縮短了物理距離，為下一步克隆提供依據(jù)。BC4F3的定位結(jié)果的表型貢獻(xiàn)率達(dá)到 60%以上，明顯高于 BC4F2的定位結(jié)果，可見近等基因系BC4F3的定位結(jié)果準(zhǔn)確度更高，可信度更高。玉米籽粒、穗軸花色苷含量兩個顯性基因的上位性研究與葉脈葉耳顏色的進(jìn)一步定位The research of two dominant epistatic effect g

14、ene about Corn kernel and cob anthocyanins content and further gene positioning of vein and auricle colorPh.D.Candidate:Wenjuan YuanSupervisor:Prof.Yilin CaiAbstractAbstractCorn is one of the largest crop acreage in the world.The black corn has high anthocyanin content ,its an excellent care product

15、 for health,and it also has an important role in peoples health.The main ingredient of black corn is anthocyanin, and anthocyanin is the main water-soluble pigment which constitutes the color of the plant petals, leaves, fruits, seeds, and other organs.Anthocyanin is made from the aglycone and gluco

16、se in the form of a glycoside bond,which is a class of flavonoid polyphenolic compounds presented in plants widely.Anthocyanin has a variety of health functions, the main function of anthocyanin is scavenging free radicals, and it also includes the function of anti-aging antioxidant.So far,the resea

17、rch on corn epistasis mostly about corn plant height, ear height, total number of leaves per plant, leaf length, leaf width ear ear and ear leaf area, the epistatic effects analysis is also based on the corn sub-rate,but there is a little researsh on corn anthocyanins epistasis.The epistasis researc

18、h can enrich the genetic basis of anthocyanins,and provide the basis for gen improvement.The leave is an important part of the plant. Veins leaf and ear leaves are the important parts of the leave.They provide a reference for the further positioning of the leaf color gene and corn pigment basic rese

19、arch.They also provide a basis for corn pigment molecular marker-assisted breeding and corn pigment Cloning.In this paper, Southwest Institute of the University of corn breeding material black corn inbred lines SDM, wood, Mo17 SDM male parent as the female parent, build two backcross populations thr

20、ough the foreground and background selection to obtain two BC4F3 III / 55near-isogenic lines, two major gene control corn grain and cob anthocyanin content epistasis.The choose another SDM male parent, wood as the female parent, foreground selection and background selection for a genetic background

21、of near-isogenic lines BC4F3, further positioning veins auricles color, specific findings are as follows:1.Study of epistasis two dominant genes kernels and cob anthocyanin content to the two groups MuS-BC4F3 and MoS-BC4F3Grain anthocyanins content in two groups of MuS-BC4F3, MoS-BC4F3 on chromosome

22、 sixth are located near to the primer S8,The tenth chromosome are located near to IDP8526-bnlg1028.Two groups of cob anthocyanin content sixth chromosome location to the primer S8 near, near tenth chromosome location to the interval IDP8526-bnlg1028.The variance of the two groups of grain and cob an

23、thocyanin content analysis found that the average content of maize grain and cob anthocyanin significant difference among different genotypes, the average content of different genotypes of grain and cob anthocyanins are also different.Two groups of nine genotypes anthocyanin average multiple compari

24、sons showed that the AABB aabb AABB AABB four genotypes anthocyanin content difference was not significant, these four genotypes anthocyanin content and AABB aabb aaBB AABB AABB five kinds significant differences in genotype anthocyanin content AABB aabb AABB AABB AABB five kinds of genotype anthocy

25、anin content was no significant difference.Visible when the two genes at the same time the presence of anthocyanin content is relatively large, only one gene action anthocyanins was no significant difference.Two groups of grain and cob anthocyanin content the two genetic epistasis analysis showed th

26、at: a gene alone are relatively low impact on the grain and cob anthocyanins, two gene interactions anthocyanins comparison large.Visible gene interaction has a significant role in the improvement of anthocyanin content.2. Auricles and veins Color group MUS-BC4F3 further positioningThe MuS-BC4F3 phe

27、notypic identification showed veins and auricles non-purple and purple two phenotypes are 1:3, in Mendel single gene segregation ratio 1:3, can exclude the interference of other genes, the target area. paragraph gene mapping ideal material.According to the F2 and BC4F2 positioning results.Increase t

28、he veins leaves near the ear gene primers and screening efforts, by electrophoresis the BC4F3 differences primer only three pairs.In order to more accurate positioning results need to design primers.In veins positioning interval the IDP8526-bnlg1028 and auricles positioning interval IDP8526-bnlg1028

29、 vein leaf ears are positioned to the same interval, so the design of the primer as long as there is difference in the veins and leaf auricle can be used to locate in the NCBI blastn that the BAC value IDP8526 AC194430.3 the BAC value bnlg1028 AC205908.3, the 2,753,143 bp from . tha

30、t the physical distance between IDP8526-bnlg1028, physical distance is too large, need to design new The primer to shorten the physical distance. One by one to find SSRHUNTER SSR loci, to find a single copy of SSR loci Primers were designed using Premier 5.0, a total of 25 pairs of primers, primer J

31、34 in the SDM wood polymorphism is better found by screening.Screening out the differences cited material and new design of primers veins leaf ear color further positioning, last veins leaf ears are positioned to J34-bnlg1028 interval, the physical distance to 1304KB, greatly shorten the physical di

32、stance clone basis for the next step.The BC4F3 positioning results phenotypic rate of more than 60%, significantly higher than the the BC4F2 positioning, the positioning of the visible and near-isogenic lines BC4F3 results higher accuracy, higher reliability.第一章第一章 文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述1.11.1 數(shù)量性狀的相關(guān)概念數(shù)量性狀的相關(guān)概念在

33、遺傳機(jī)制制中，數(shù)量性狀受多個基因來控制的，數(shù)量性狀的基因?qū)Νh(huán)境比較敏感，基因的作用與環(huán)境條件有關(guān)，關(guān)于數(shù)量性狀的多基因假說是：數(shù)量性狀基因是由多對微效基因聯(lián)合作用的，各對微效基因的效應(yīng)差不多，而且可以累加，也可以稱這些微效基因為累加基因，由于每對微效基因?qū)Ρ硇托誀畹挠绊戄^小，基因太多無法一個一個去辨認(rèn)，只能將表型按照多基因體系來進(jìn)行研究，微效基因之間的顯性效應(yīng)與隱性效應(yīng)不怎么明顯，一般用大寫字母表示增效，小寫字母表示減效作用。微笑基因?qū)Νh(huán)境非常敏感，所以數(shù)量性狀的表型性狀容易受環(huán)境的影響，微效基因還有多個效果，不僅對數(shù)量性狀產(chǎn)生作用還對其他別的性狀有一定的作用。微效基因與主效基因間可以重組，連

34、鎖等。數(shù)量性狀基因與質(zhì)量性狀基因的異同之處：數(shù)量性狀的變異是連續(xù)性的而質(zhì)量性狀的變異是不連續(xù)的，數(shù)量性狀的基因的雜交后代不能明確分組，質(zhì)量性狀的基因的雜交后代可以按孟德爾定律進(jìn)行分組，數(shù)量性狀的基因受環(huán)境的影響較大，受環(huán)境的變化而變化，遺傳力小，不能穩(wěn)定遺傳，而質(zhì)量性狀的基因是可以穩(wěn)定遺傳的?？刂茢?shù)量性狀的基因在特定的時空環(huán)境下進(jìn)明顯，行表達(dá)，基因的表達(dá)因環(huán)境而不一樣，有的環(huán)境表性效果比較明顯，有的環(huán)境下表型效果不所以，數(shù)量性狀基因經(jīng)常存在與環(huán)境之間的相互作用。質(zhì)量性狀的基因受環(huán)境影響不明顯，可以穩(wěn)定遺傳。質(zhì)量性狀的基因一般用概率的方法來進(jìn)行分析也可以用系譜法來分析，數(shù)量性狀基因的研究需要用統(tǒng)

35、計學(xué)和遺傳學(xué)的方法來研究。作物的表型是由基因型，基因型與環(huán)境的作用和誤差三者共同組成的，一般用三者的方差來計算表型的方差，前兩者的方差是可以遺傳的，誤差方差是不可以遺傳的。數(shù)量性狀的基因經(jīng)常存在一因多效的情況，生物體的數(shù)量性狀間有一定程度的關(guān)聯(lián)，采用協(xié)方差分析來分析這種變異情況。主效基因，微效基因，修飾基因都對數(shù)量性狀有作用，數(shù)量性狀的表型受這三種基因的表達(dá)，三種基因?qū)?shù)量性狀的影響不同，主效基因的影響較大，對數(shù)量形狀的表型起的作用相對來說比較大，一般情況數(shù)量性狀是由幾個主效基因共同控制的，修飾基因?qū)Ρ硇偷挠绊戄^小，主要是對主效基因起修飾的作用，而微效基因?qū)Ρ硇偷挠绊懸埠苄?，這些微效基因的作用

36、是可以累加的，對環(huán)境很敏感?；虻募有孕?yīng)，顯性效應(yīng)，上位性效應(yīng)的定義分別是，加性效應(yīng)是等位基因的累加效應(yīng)，是遺傳中可以固定的因素，也稱為育種值，顯性效應(yīng)是等位基因之間的互作效應(yīng)，是遺傳中不能固定的因素，可以產(chǎn)生雜種優(yōu)勢。上位性效應(yīng)是指不同基因位點(diǎn)非等位基因間的相互作用。這三種效應(yīng)在遺傳育種中有不同的效應(yīng)，加性效應(yīng)在上下代之間可以穩(wěn)定遺傳，選擇的過程中可以累加，可以很快將基因純和，具有較高加性效應(yīng)的數(shù)量性狀通過世代選擇容易達(dá)到育種的效果，顯性效應(yīng)與雜種優(yōu)勢有密切關(guān)系，在雜交育種中加以利用，但是這種顯1 / 55性效應(yīng)在逐代選擇的過程中逐漸減弱最后消失，會影響育種中早代選擇的效果，所以在育種中對

37、于以顯性為主的數(shù)量性狀以高代選擇為主。上位性效應(yīng)是由非等位基因間互作產(chǎn)生的，對數(shù)量性狀的表型有很大的作用，加性效應(yīng)加性效應(yīng)互作產(chǎn)生的上位性效應(yīng)可以遺傳并逐漸固定，加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)產(chǎn)生的上位性效應(yīng)與雜種優(yōu)勢有關(guān)，在低世代的育種時影響數(shù)量性狀的選擇效果。1.21.2 QTLQTL 定位的原理與方法定位的原理與方法.1 定位的原理定位的原理數(shù)量性狀基因座是指控制數(shù)量形狀的基因在基因組中的位置，QTL 定位的理論依據(jù)就是Morgen 的連鎖遺傳規(guī)律，利用分子標(biāo)記定位 QTL，分析標(biāo)記與目標(biāo) QTL 間的連鎖關(guān)系。用交換律來計算。常用的分子標(biāo)記有：RFLP，RAPD,AFLP,SSR,

38、SNP,等，RFLP 早期使用比較多，SSR 標(biāo)記操作簡單快捷，標(biāo)記多態(tài)性高，適用于大批量的應(yīng)用。.2 定位的方法定位的方法通過QTL與標(biāo)記間的連鎖關(guān)系，確定QTL于標(biāo)記間的距離并將其定位到遺傳圖譜上，根據(jù)標(biāo)記數(shù)目的不同分為單標(biāo)記，雙標(biāo)記，多標(biāo)記。統(tǒng)計方法有方差分析法，均值分析法，矩估計法，最大似然法。自20世紀(jì)60年代初提出單一標(biāo)記分析方法以來，QTL定位方法有了長足的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)展了適合不同倍性1。與同源多倍體2。、連續(xù)性與間斷性變量3、靜態(tài)與動態(tài)性狀、單一性狀與多個相關(guān)性狀聯(lián)合4、單個組合與多個組合聯(lián)合以與兩個親本與多個親本甚至育成品種群體的QTL定位方法。常用的QTL作

39、圖方法主要有單標(biāo)記分析法，性狀標(biāo)記回歸法，性狀-QTL回歸法，性狀QTL回歸法包括單區(qū)間作圖法（The interval mapping IM） ，復(fù)合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping,CIM） ，多重區(qū)間作圖法（Multifold interval mapping MIM） ，基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping based mixed linear model MCIM） ，完備區(qū)間作圖法（Inclusive Composite Interval Mapping,ICIM） 。 區(qū)間作圖法（Th

40、e interval mapping IM）是由個體目標(biāo)性狀觀察值與雙側(cè)分子標(biāo)記建立的線性模型的基礎(chǔ)上，利用最大似然法，對標(biāo)記區(qū)間的某一點(diǎn)可能存在的 QTL 進(jìn)行檢測，進(jìn)而獲得極大似然估計值。其遺傳假設(shè)是，數(shù)量性狀遺傳變異只受一對基因控制，表型變異受遺傳效應(yīng)（固定效應(yīng)） 和剩余誤差（隨機(jī)效應(yīng)） 控制，不存在基因型與環(huán)境的互作。區(qū)間作圖法可以估算 QTL 加性和顯性效應(yīng)值。與單標(biāo)記分析法相比，區(qū)間作圖法具有以下特點(diǎn)：能從支撐區(qū)間推斷 QTL 的可能位置；可利用標(biāo)記連鎖圖在全染色體組系統(tǒng)地搜索 QTL,如果一條染色體上只有一個 QTL，則 QTL 的位置和效應(yīng)估計趨于漸進(jìn)無偏； QTL 檢測所需的

41、個體數(shù)大大減少。但 IM 也存在不足： QTL 回歸效應(yīng)為固定效應(yīng)；無法估算基因型與環(huán)境間的互作（QE） ，無法檢測復(fù)雜的遺傳效應(yīng)（如上位效應(yīng)等）;當(dāng)相鄰 QTLs 相距較近時，由于其作圖精度不高，QTLs 間相互干擾導(dǎo)致出現(xiàn) Ghost QTL；一次只應(yīng)用兩個標(biāo)記進(jìn)行檢查，效率很低。 復(fù)合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping,CIM）是 Zeng5 提出的結(jié)合了區(qū)間作圖和多元回歸特點(diǎn)的一種 QTL 作圖方法。其遺傳假定是，數(shù)量性狀受多基因控制。該方法中擬合了其他遺傳標(biāo)記，即在對某一特定標(biāo)記區(qū)間進(jìn)行檢測時，將與其他 QTL 連鎖的標(biāo)記也擬合在模型中以控

42、制背景遺傳效應(yīng)。CIM 主要優(yōu)點(diǎn)是： 由于仍采用 QTL 似然圖來顯示 QTL 的可能位置與顯著程度，從而保證了 IM 作圖法的優(yōu)點(diǎn)； 假如不存在上位性和 QTL 與環(huán)境互作，QTL 的位置和效應(yīng)的估計是漸進(jìn)無偏的；以所選擇的多個標(biāo)記為條件（即進(jìn)行的是區(qū)間檢測） ，在較大程度上控制了背景遺傳效應(yīng)，從而提高了作圖的精度和效率。存在的不足是： 由于將兩側(cè)標(biāo)記用作區(qū)間作圖，對相鄰標(biāo)記區(qū)間的 QTL 估計會引起偏離; 同 IM 一樣，將回歸效應(yīng)視為固定效應(yīng)，不能分析基因型與環(huán)境的互作與復(fù)雜的遺傳效應(yīng)（如上位效應(yīng)等） ; 當(dāng)標(biāo)記密度過大時，很難選擇標(biāo)記的條件因子。 多重區(qū)間作圖法（Mult

43、ifold interval mapping MIM）針對以往作圖方法的不足，C.H.Kao 和 Z.B.ZENG 利用 Cock 模型將 QTL 作圖模型擴(kuò)展到多重 QTLs 模型，一次可檢測多個 QTLs,并可有效分析上位性。這種新的作圖法被命名為多重區(qū)間作圖法，它屬于同時在多個區(qū)間上檢測多個 QTLs 的方法，待估參數(shù)多，計算量大。所以 KAO 和 ZENG6利用 EM 算法推導(dǎo)出一個用于基因定位模型上估計 MLE 和其漸進(jìn)變異矩陣的一般化公式，KAO7等以 Cockerham 模型8定義遺傳參數(shù)并用該一般化公式作為估計方法，提出了多重區(qū)間作圖法進(jìn)行基因定位。突破了回歸方法的局限性，在模

44、型中同時使用多個標(biāo)記區(qū)間來尋找多個 QTLs。極提高了作圖的精度和效率。但是 MIM 模型相當(dāng)復(fù)雜，計算需要很長時間，待估參數(shù)的數(shù)目隨著 QTL 的增大呈指數(shù)增長，而且如何確定合適臨界值目前還沒有現(xiàn)成理論，QTL 效應(yīng)可能會被側(cè)連標(biāo)記區(qū)間之外的標(biāo)記變量吸收，還有就是標(biāo)記背景不同對作圖結(jié)果影響很大，難以推廣到上位性互作 QTL 的定位，章元明等研究認(rèn)為，MIM 只能檢測具有主效 QTL 間互作，對于效應(yīng)小的 QTL 很難檢測到。 基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping based mixed linear model MCIM）朱軍9

45、提出了用隨機(jī)效應(yīng)的預(yù)測方法獲得基因型效應(yīng)與基因型與環(huán)境互作效應(yīng)，然后再用區(qū)間作圖法或復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行遺傳主效應(yīng)與基因型與環(huán)境互作效應(yīng)的 QTL 定位分析。該方法的遺傳假定是數(shù)量性狀受多基因控制，它將群體均值與 QTL 的各項遺傳效應(yīng)看作為固定效應(yīng)，而將環(huán)境、QTL 與環(huán)境、分子標(biāo)記等效應(yīng)看作為隨機(jī)效應(yīng)。由于 MCIM 將效應(yīng)值估3 / 55計和定位分析相結(jié)合，既可無偏地分析 QTL 與環(huán)境的互作效應(yīng)，又提高了作圖的精度和效率。此外該模型可以擴(kuò)展到分析具有加加、加顯、顯顯上位的各種遺傳主效應(yīng)與其與環(huán)境互作效應(yīng)的 QTL。利用這些效應(yīng)值的估計，可預(yù)測基于 QTL 主效應(yīng)的普通雜種優(yōu)勢和基于QTL

46、 與環(huán)境互作效應(yīng)的互作雜種優(yōu)勢，因而其具有廣闊的應(yīng)用前景 完備區(qū)間作圖法（Inclusive Composite Interval Mapping,ICIM）完備區(qū)間作圖法10利用所有標(biāo)記的信息，通過逐步回歸選擇重要的標(biāo)記變量并估計其效應(yīng)，然后利用逐步回歸得到的線性模型校證表型數(shù)據(jù)，并利用校正后的數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組的一維和二維掃描。完備區(qū)間作圖法的優(yōu)點(diǎn)是簡化了 CIM 中控制背景遺傳變異過程，ICIM 有較低的抽樣誤差，較高的作圖效率，ICIM 對作圖參數(shù)有很好的穩(wěn)健性，有 QTL 的區(qū)域 ICIM 有顯著的 LOD 值，反之沒有 QTL 的區(qū)域 LOD 值為 0，容易推廣到上位性

47、作圖，在上位性作圖時，不僅可以檢測到有加性效應(yīng)的 QTL 間的互作，而且還可以檢測到?jīng)]有明顯加性效應(yīng)的 QTL 間的互作。模擬研究和實際數(shù)據(jù)的分析表明完備區(qū)間作圖法是一個有效的 QTL 定位方法。1 13 3 QTLQTL 定位方法的最新進(jìn)展定位方法的最新進(jìn)展.1 QTLQTL 動態(tài)定位動態(tài)定位單標(biāo)記分析法、區(qū)間作圖法、復(fù)合區(qū)間作圖法、多重區(qū)間作圖法等均是針對某一時間點(diǎn)數(shù)量性狀觀測值的QTL定位,即靜態(tài)QTL定位(static mapping，SM)。靜態(tài)QTL定位只反映了QTL從發(fā)育初始到觀察時期的累積效應(yīng)，難于掌握不同發(fā)育時期各個QTL的作用和提供有關(guān)QTL表達(dá)過程的信息。

48、為此，吳為人等提出了動態(tài)定位方法(dynamic mapping，DM)，又稱與時間有關(guān)的QTL定位(timerelatedQTL mapping)11。該方法可以有效利用性狀發(fā)育過程中的遺傳信息，大幅度提高QTL定位的靈敏度和準(zhǔn)確性，揭示QTL的表達(dá)動態(tài)瞄12。.2 eQTLeQTL 定位定位2001年Jansen等提出了eQTL定位方法13。即利用表型觀測值、分子標(biāo)記和表達(dá)譜數(shù)據(jù)定位出控制數(shù)量性狀的基因。每一基因的表達(dá)譜作為一個性狀，分析分離群體所有個體的表達(dá)譜，然后檢測分離群體中標(biāo)記與表達(dá)譜性狀間的連鎖。將表達(dá)譜作為數(shù)量性狀所定位得到的QTL稱為eQTL。當(dāng)eQTL的遺傳

49、連鎖與該基因的位置一致時，便可確定與數(shù)量性狀有關(guān)的基因。目前eQTL定位在酵母14、玉米和老鼠15等中得以應(yīng)用。由于獲得表達(dá)譜數(shù)據(jù)成本較高，該方法還未得到廣泛應(yīng)用。1.31.33 3 種質(zhì)資源新基因發(fā)掘的種質(zhì)資源新基因發(fā)掘的 QTLQTL 定位方法定位方法作物QTL定位群體一般是兩純合近交系的雜交后代，往往要求兩近交系間差異較大。但是，若兩者攜帶一樣等位基因，即使其效應(yīng)較大。也不能被檢測到。因而，Rao等提出了增加親本數(shù)目的四向雜交的QTL定位方法16。在老鼠QTL定位中甚至出現(xiàn)八向雜交17。目前種質(zhì)資源新基因發(fā)掘的QTL統(tǒng)計方法主要包括關(guān)聯(lián)分析、“in silico”方法和基于IBD的混合模

50、型方法。Grope等提出了一種“in silico”QTL定位方法，在15個近交系組成的群體中定位了老鼠疾病相關(guān)性狀的多個QTL18?；贗BD的混合模型方法的主要思想是利用品種的系譜關(guān)系計算品種間的后裔同樣值(identity by decent，IBD)，并將IBD值嵌入方差組分模型以定位QTL的位置與效應(yīng)；然后，用最優(yōu)線性無偏預(yù)測(best linear unbiased prediction，BLUP)法預(yù)測出各品種的QTL效應(yīng)值。根據(jù)每一品種各QTL效應(yīng)預(yù)測值，可進(jìn)行新品種的親本選配和分子設(shè)計育種，也可研究基因在品種中的傳遞規(guī)律19-20。Zhang等應(yīng)用該方法定位了玉米GDUSHD

51、(growing degree day heat units to pollen shedding)的8個QTL20。.4 QTLQTL 精細(xì)定位精細(xì)定位實際研究中，由于受到費(fèi)用和工作量的限制，初級作圖群體一般都比較小，無論如何改進(jìn)統(tǒng)計分析方法，也無法使初級定位達(dá)到很高的分辨率或精度。對于QTL精細(xì)定位，一般采取構(gòu)建次級定位群體的方法，消除群體背景遺傳因子的干擾。這些群體包括近等基因系、回交近交系群體21導(dǎo)入系群體22，或單片段代換系群體 23。這類群體是由供體親本與受體親本經(jīng)過多代回交以后選育形成的，株系間除目的性狀外遺傳背景基本一致。應(yīng)用近等基因系等次級定位群體可以將遺傳背

52、景的干擾效應(yīng)降低至最小，極提高QTL定位的精度。在此基礎(chǔ)上，通過染色體登陸和行走，最終可以實現(xiàn)QTL的克隆24-25。近年來對作物QTL的研究發(fā)展很快，QTL定位方法在作物新基因源的挖掘，農(nóng)作物遺傳育種等方面發(fā)揮了很大作用。研究設(shè)計高效的QTL定位方法勢在必行，包括建立新的作圖群體、新的統(tǒng)計分析方法、以與以一種分子標(biāo)記方法輔助的QTL選擇等。只有這樣，才能夠全面認(rèn)識和利用植物數(shù)量性狀基因，服務(wù)于育種實踐，加快育種進(jìn)程。1.41.4 花色苷研究進(jìn)展花色苷研究進(jìn)展.1 花色苷研究現(xiàn)狀花色苷研究現(xiàn)狀近60多年來,對花色苷代的遺傳學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行了全面而深入的研究。植物花色苷的生物合成

53、是從莽草酸代途徑合成苯丙氨酸和脂肪酸合成代合成丙二酰CoA開始，經(jīng)苯丙烷類途徑合成26。根據(jù)基因?qū)ㄉ丈锖铣傻淖饔每煞譃榻Y(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因27。結(jié)構(gòu)基因直接編碼花色苷生物合成途徑中的生物合成酶類如PAL、4CL、CHS、CHI、 F3H、DFR、F3H、F35 H、ANS、3GT等基因；另一類是調(diào)節(jié)基因，它們調(diào)控花色苷生物合成基因的表達(dá)強(qiáng)度和模式同時控制花色苷在時空上的變化，如AN1、AN2、JAFl3和ANL1等28。玉米是研究植物花色苷代途徑并分離基因的重要物種之一，目前已有一些結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因被分離和克隆出來。玉米花色苷合成途徑中已分離出的結(jié)構(gòu)基因有5 / 55c2、whp、chi1、

54、pr1、f3h、a1、a2、bz1、bz2 29paz1990除此之外，在玉米中還分離出r、r(S)、r(Sn)、r(Lc)、b、c1、pl、vp1、in1、anl1、zm等調(diào)節(jié)基因30-31holton1995,petroni et al 2000，這些基因的編碼產(chǎn)物并非花色苷合成途徑中的酶，但是其表達(dá)水平，也會明顯影響玉米植株、籽粒、穗軸等器官中色素的積累。有研究結(jié)果指出，在玉米籽粒顏色的進(jìn)化過程中，調(diào)節(jié)基因的作用非常重要。早期有關(guān)玉米色素的研究與易于觀察的色澤變異緊密結(jié)合，早在1900年以前，玉米紅色和藍(lán)色籽粒的分離現(xiàn)象就引起植物學(xué)家的重視，隨后通過大量雜交試驗，研究了玉米的色澤變異與基

55、因位點(diǎn)。Emerson32選擇幾種彩色玉米對其遺傳進(jìn)行了研究，基于完全連鎖理論，認(rèn)為玉米籽粒不同色澤之間不是獨(dú)立遺傳的。Hayes33認(rèn)為玉米種皮的顏色受一系列復(fù)等位基因控制，而非2個或者更多的緊密連鎖基因控制。Anderson34研究發(fā)現(xiàn)，某些有關(guān)玉米種皮顏色的基因在遺傳上是等位基因或緊密連鎖，有大量的基因參與性狀的表達(dá)。Rhoades35研究基因劑量效應(yīng)對玉米糊粉層顏色的影響，指出影響玉米糊粉層顏色的4個基因A1、c、R和A2必須至少各有一個顯性基因，才能使糊粉層顯顏色。麗娜等36通過徒手切片和分光光度法，研究玉米籽粒色澤的組成、分布和積累規(guī)律表明，不同顏色的玉米其色素組成和分布均不同；其

56、中2個黑玉米材料紫糯香和西星黑糯1號的籽粒色素成分主要是花色苷，且主要存在于糊粉層中。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，玉米色素相關(guān)基因的定位也取得了進(jìn)展。Sourdille等37對含392單株的F2群體的葉緣、主莖、穎片和花絲等顏色基因的QTL定位，檢測到8個位點(diǎn)，分別位于第2、第3、第4、第5、第7、第9、第10染色體，其中第2和第10染色體上的QTL對表型的貢獻(xiàn)率最大。Brown等38利用IL731AW-6786W的F2：3群體，通過RFLP標(biāo)記，對控制玉米葉片、果皮、莖稈等顏色的基因進(jìn)行QTL定位，通過2年的表型鑒定，檢測到2個與花色苷含量相關(guān)的QTL，位于第10和第5染色體，分別解釋表型變異的

57、188和71。Lee等39刮用2個白玉米自交系(其中個自交系籽粒上有紫色條紋)構(gòu)建了F2：3群體。采用58個SSR標(biāo)記，2年重復(fù)檢測到1個控制白玉米籽粒上紫色條紋的QTL，位于第6染色體，其最近標(biāo)記為umc1979，從而推測控制PKS的基因就是與這個位點(diǎn)緊密相連的pll基因。黑玉米是玉米栽培中的一個變種，因籽粒中色素成分含量高而成黑色（紫色） 。花色苷是構(gòu)成植物花瓣、葉片、果實、種子等器官顏色的最主要水溶性色素 40-41Klein et al., 1989; Tanaka et al.,2008，是由苷元與葡萄糖以糖苷鍵形式結(jié)合形成的一類廣泛存在于植物體的類黃酮多酚化合物42-43（昶靈和郭

58、, 2007; 建霞等, 2009） 。.2 花色苷結(jié)構(gòu)和代途徑花色苷結(jié)構(gòu)和代途徑花色苷是花色素和苷元與糖以糖苷鍵形式結(jié)合，其結(jié)構(gòu)母核是2-苯基苯并吡喃陽離子，屬于類黃酮化合物。自然界已知的花色苷根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的差異可以分為22類 44-45(Andersen et al., 2002; Devia et al., 2002)，其中食品中常見的包括6類46(Escribano et al., 2004)。即矢車菊色素（50%） 、天竺葵色素（12%） 、飛燕草色素（12%） 、芍藥色素（12%） 、牽牛色素（7%）和錦葵色素（7%） ，6 類花色苷的結(jié)構(gòu)如圖471.1 (Kong

59、 et al., 2003)。自然條件下花色素（anthocyanidins）通常與葡萄糖、木糖等糖類結(jié)合，其中矢車菊素-3-葡萄糖苷在自然界中分布最廣47(Kong et al., 2003)。黑（紫）玉米中所含的花色苷主要是矢車菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-glu）, 矢車菊素-3半乳糖苷（Cy-3-gal） ，天竺葵色素-3-葡萄糖苷（Pg-3-glu）, 芍藥色素-3-葡萄糖苷Pn-3-glu等48-49（Dpascual-teresa et al., 2002; Cevallos-casals et al., 2003） ?；ㄉ盏纳锎緩绞悄壳把芯康淖顬閺V泛和深入的植物次生代途徑

60、50（Bartel and Matsuda, 2003） 。玉米、金魚草和矮牽牛是研究花色苷代途徑并分離基因的重要物種，代途徑中的多數(shù)反應(yīng)在三個物種中一樣，在某些反應(yīng)上不同的物種也存在差別。例如矮牽?；ㄍǔＧ闆r下不產(chǎn)生天竺葵色素，玉米和金魚草不能產(chǎn)生飛燕草色素。圖 1.1 食品中主要花色苷的結(jié)構(gòu)Figure1.1The main structures of anthocyanins in food花色苷 AnthocyaninR1R2矢車菊色素 CyanidinOHH飛燕草色素 DelphinidinOHOH牽牛色素 PetunidinOCH3OH錦葵色素 Malvidin天竺葵色素 Pela