細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告1-動(dòng)物細(xì)胞融合

1、. 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2011年09 月 16 日 姓名 孫嘉璋 系年級(jí) 2010及臨床八年 組別 同組者 科目 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 題目 動(dòng)物細(xì)胞融合 學(xué)號(hào) 201000232115 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法2. 學(xué)習(xí)化學(xué)融合和電融合的基本操作3. 觀察動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程中的行為和變化【實(shí)驗(yàn)原理】1. 病毒誘導(dǎo)融合仙臺(tái)病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細(xì)胞的融合。這類(lèi)病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合，也可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生融合。2. 化學(xué)誘導(dǎo)融合很多化學(xué)試劑都能誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇（PEG），二

2、甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂，磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)的過(guò)程中相接處的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合?；瘜W(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動(dòng)、植物細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學(xué)融合劑。3. 電擊誘導(dǎo)融合包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊破細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融

3、合過(guò)程易控制，融合概率高，作用機(jī)制明確，可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)?！緦?shí)驗(yàn)材料】1. 材料 雞血紅細(xì)胞2. 試劑 50%PEG、0.85%氯化鈉溶液、GKN緩沖溶液3. 器材 倒置顯微鏡、離心機(jī)、量筒、注射器、載玻片、蓋玻片、離心管等【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 取離心管，加入冷藏的雞血1ml，加入4ml 0.85%氯化鈉溶液，搖勻2. 將離心管放入離心機(jī)中，以1000-1200r/min的速度離心5分鐘左右。取出離心管，棄掉上清液，再加入4ml氯化鈉溶液，重復(fù)以上操作。3. 取離心管，棄掉上清液后，按照紅細(xì)胞沉積的體積，加入1-2mlGKN溶液，搖勻。4. 取以上溶液1ml，加入3mlGKN溶液，再次搖勻5. 取

4、以上溶液1ml，加入0.5mlPEG，先靜置1-2min，再將溶液搖勻后，靜置1-2min。6. 用滴管取溶液制成涂片，置于顯微鏡下觀察。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】最初，在顯微鏡下觀察到的細(xì)胞如下二圖所示。其中，第二圖中指針?biāo)傅膬杉?xì)胞緊貼在一起，有相互融合的趨勢(shì)。由于在第二步稀釋的過(guò)程中未充分振蕩，使得許多細(xì)胞都聚集在一起成堆，影響了細(xì)胞的觀察。因此，我又重新充分稀釋并振蕩了細(xì)胞懸液，并重新制備了涂片，所得的新影響如下圖：在上圖中，可以明顯看出箭頭所指的兩細(xì)胞中間的細(xì)胞膜已經(jīng)消失。有著明顯的融合的現(xiàn)象了?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果分析與注意事項(xiàng)】本次試驗(yàn)最終觀察到了明顯的細(xì)胞融合，可以說(shuō)較為成功。其中重新稀釋振蕩細(xì)胞懸液

5、并重置涂片，使得能夠看到明顯的細(xì)胞融合現(xiàn)象。而其他實(shí)驗(yàn)組也出現(xiàn)了類(lèi)似情況，都是細(xì)胞懸液稀釋程度不夠，制成的圖片在顯微鏡下呈現(xiàn)大塊的細(xì)胞堆積，難以觀察到明顯而清晰的單個(gè)細(xì)胞，更不用說(shuō)兩個(gè)細(xì)胞的融合了。因此在本次試驗(yàn)中，第一個(gè)注意事項(xiàng)便是充分地稀釋和振蕩搖勻細(xì)胞懸液，達(dá)到試驗(yàn)的細(xì)胞濃度要求（17000個(gè)/毫升左右）。許多實(shí)驗(yàn)組由于在制備的第五步（滴入PEG）過(guò)程中，滴入PEG后立刻搖勻了細(xì)胞懸液，并沒(méi)有讓PEG沉降到細(xì)胞懸液底部后，在保持高濃度的情況下與接觸面的細(xì)胞充分反應(yīng)，使得所觀察到了細(xì)胞融合率不高，觀察效果不明顯。因此，讓PEG與細(xì)胞懸液分層靜置足夠的時(shí)間也是十分重要的。另外，包括我組在內(nèi)的

6、許多實(shí)驗(yàn)組在觀察細(xì)胞是發(fā)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞總是在不規(guī)則移動(dòng)，十分影響細(xì)胞的觀察。根據(jù)指導(dǎo)老師的說(shuō)法，這是由于涂片的懸液量太多導(dǎo)致細(xì)胞在懸液內(nèi)流動(dòng)所致。因此，在制片時(shí)，適當(dāng)?shù)膽乙毫渴切枰⒁獾?。不能過(guò)多，當(dāng)然也不能過(guò)少。附：細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用1. 單克隆抗體動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個(gè)制造一種專(zhuān)一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖

7、而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱(chēng)為單克隆抗體。1975年分子生物學(xué)家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠脾細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無(wú)限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可形成單細(xì)胞系，即單克隆。利用培養(yǎng)或小鼠腹腔接種的方法，便能得到大量的、高濃度的、非常均一的抗體，其結(jié)構(gòu)、氨基酸順序、特異性等都是一致的，而且在培養(yǎng)過(guò)程中，只要沒(méi)有變異，不同時(shí)間所分泌的抗體都能保持同樣的結(jié)構(gòu)與機(jī)能

8、。這種單克隆抗體是用其他方法所不能得到的。這項(xiàng)新技術(shù)從根本上解決了在抗體制備中長(zhǎng)期存在的特異性和可重復(fù)性問(wèn)題，可用于探討蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)；淋巴細(xì)胞亞群的表面新抗原；組織相容性抗原；激素和藥物的放射免疫（或酶免疫）分析；腫瘤的定位和分類(lèi)；純化微生物和寄生蟲(chóng)抗原；免疫治療和與藥物結(jié)合的免疫-化學(xué)療法 (“導(dǎo)彈”療法,利用單克隆抗體與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，將藥物帶至病灶部位。因此，單克隆抗體可直接用于人類(lèi)疾病的診斷、預(yù)防、治療以及免疫機(jī)制的研究，為人類(lèi)惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開(kāi)辟了廣闊前景。2. 植物細(xì)胞融合育種植物細(xì)胞融合可分為體細(xì)胞雜交和配子-體細(xì)胞雜交，前者是指不經(jīng)過(guò)有性生殖，而直接由體細(xì)胞原

9、生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，形成愈傷組織，并再生出植株的過(guò)程，后者是指性細(xì)胞原生質(zhì)體和二倍體原生質(zhì)體融合產(chǎn)生三倍體雜種細(xì)胞，形成愈傷組織，并再生出植株的過(guò)程。植物細(xì)胞融合是植物細(xì)胞工程的一個(gè)重要分支，是一種突破物種生殖隔離、創(chuàng)造遠(yuǎn)緣雜交的新途徑。自1960年Cocking用酶解法分離出番茄根原生質(zhì)體后，Nataga和Takebe1970年首次利用煙草葉分離出原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株；1975年以色列的Vardi等首次從木本植物shamonti甜橙珠心組織誘導(dǎo)胚愈傷組織，并從愈傷組織分離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)通過(guò)胚狀體再生出植株；在禾本科植物中，除災(zāi)珍珠谷、紫狼尾草用懸浮細(xì)胞為材料，較早獲得原生質(zhì)體再生植株外，直到1985年Fujimura等率先在水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得了再生植株，才出現(xiàn)了重大突破?，F(xiàn)在已從許多種內(nèi)、種間、屬間甚至亞科間的體細(xì)胞雜交獲得雜交細(xì)胞系或雜種植物。隨著多種細(xì)胞原生質(zhì)體的成功培養(yǎng)和融合技術(shù)的不斷改進(jìn)，植物細(xì)胞融合獲得了巨大成功。目前已經(jīng)成功得到的融合植株有甘藍(lán)-青菜、大豆-馬塘草、矮牽牛-龍面花、大