受體研究方法

1、受體概論之受體研究方法 2二、受體研究的內(nèi)容* 受體與配基的相互作用；* 受體的激活機制；* 后 續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的啟動機制；* 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的路徑；* 引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。3三、受體與配基結(jié)合反應(yīng)的基本特征*可飽和性 細(xì)胞特定的受體，數(shù)量有限。*可逆性 內(nèi) 解離；外 可逆和不可逆*特異性和親和力 配基、組織或器官特異*和生物學(xué)效應(yīng)相關(guān) 4四、受體研究的意義* 受體是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的有高度特異性的“門戶”，而細(xì)胞功能的改變是乃許多疾病的基礎(chǔ)，因此研究受體結(jié)構(gòu)功能的改變和各種重要疾病發(fā)病機制的關(guān)系受到高度重視；5* 尋找有高度選擇性的藥物一直是科學(xué)家的追求目標(biāo)，受體的激動劑、拮抗劑以及調(diào)節(jié)受體結(jié)構(gòu)和功能的

2、藥物正是這方面極有前途的研究對象。6* * 從更深層次上看，受體和配給的從更深層次上看，受體和配給的結(jié)合屬于研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的結(jié)合屬于研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的重要內(nèi)容，在分重要內(nèi)容，在分子子生物學(xué)已進(jìn)入生物學(xué)已進(jìn)入后基因組時代的今天，這方面的后基因組時代的今天，這方面的研究有很重要的理論意義。研究有很重要的理論意義。第一節(jié)第一節(jié) 受體的放射配基結(jié)合分析受體的放射配基結(jié)合分析8第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理20世紀(jì)20年代末A.J.Clark發(fā)現(xiàn)藥物效應(yīng)與受體結(jié)合量呈正比且藥物活性與受體親和性有關(guān)。9提出占領(lǐng)理論：受體與配基以單分子相互作用（分子比1：1），結(jié)核反應(yīng)是可逆的，親和性相同，配基在結(jié)合

3、和解離后不被代謝，也不與其它類型受體結(jié)合，受體與配基結(jié)合產(chǎn)生的生物效應(yīng)的強度與受體被占領(lǐng)的量成正比，受體結(jié)合反應(yīng)平衡后服從質(zhì)量作用定律。1020世紀(jì)60年代初建立受體放射配基結(jié)合分 析（Radioligand Binding Assay of Receptors, RBA） 方法11受體放射配基結(jié)合分析法一、放射性配基的制備 *對放射性配基的要求 ： 放射比活度高 親和力高 特異性高 穩(wěn)定性好 12125I標(biāo)記放射性配基的制備（可查相關(guān)文獻(xiàn)） 1 氯胺-T法，N-氯代甲苯磺酰胺鈉鹽 2 Iodogen法，商品名為氯甘脲 3 乳過氧化物酶法 4 偶聯(lián)標(biāo)記法，標(biāo)記游離氨基13受體標(biāo)本的制備1 組織

4、切片 新鮮組織冰凍切片-離體放射配基結(jié)合反應(yīng)常規(guī)超薄切片電鏡自顯影2 完整活細(xì)胞 懸浮細(xì)胞：加入放射性配基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取少量細(xì)胞，測量放射性。14貼壁細(xì)胞：待細(xì)胞長到90%左右去掉培養(yǎng)基，換為配基結(jié)合反應(yīng)的緩沖液，不作成懸液，直接向貼壁細(xì)胞中加入放射性配基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。 反應(yīng)結(jié)束后，用冰冷的緩沖液洗去多余的游離配基，然后收集細(xì)胞，測定放射性。153 亞細(xì)胞組分的差速離心法分離 全過程在4C下進(jìn)行。 組織勻漿上清液 上清液 上清液（核受體） （800-3500g，15分鐘）-（10000-30000g，20min）-（100000g，60min） 注意問題： 除去內(nèi)源性配基和蛋白水解

5、酶 受體標(biāo)本保存，-70C保存 受體蛋白從從膜結(jié)構(gòu)或核中溶脫成可溶性受體，洗滌或用溶脫buffer。 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)圖圖10 10 免疫組織化學(xué)原理模式圖免疫組織化學(xué)原理模式圖 抗原抗原 抗體抗體熒光素?zé)晒馑乩备^氧化物酶辣根過氧化物酶膠體金膠體金圖圖11 11 免疫組織化學(xué)（熒光素標(biāo)記）免疫組織化學(xué)（熒光素標(biāo)記）毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞呈vWFvWF陽性陽性 圖圖12 12 免疫組織化學(xué)（辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫組織化學(xué)（辣根過氧化物酶標(biāo)記）胰島胰島B B細(xì)胞呈胰島素陽性細(xì)胞呈胰島素陽性圖圖13 13 免疫組織化學(xué)電鏡免疫組織化學(xué)

6、電鏡圖圖示上皮細(xì)胞膜示上皮細(xì)胞膜MAMMAM6 6蛋白蛋白 （A A 膠體金標(biāo)記膠體金標(biāo)記 B B 辣根過氧化物酶標(biāo)記）辣根過氧化物酶標(biāo)記）圖圖18 18 體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞 （免疫組織化學(xué)染色顯示肌動蛋白）（免疫組織化學(xué)染色顯示肌動蛋白） 24抗原抗體反應(yīng)是特異性最強的反應(yīng)之一，免疫細(xì)胞化學(xué)所用的抗體必須是特異性強的多價或單價抗體，具有高度的認(rèn)別能力，在抗原識別上可達(dá)到單個氨基酸的水平，這是其它組織化學(xué)方法難以相比的。252627缺點：無法測定受體配基反應(yīng)的親和性282930313233343536373839404142434445464748495051525354

7、555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990 二、引起假陰性和假陽性結(jié)果的原因二、引起假陰性和假陽性結(jié)果的原因 133134原位雜交術(shù)原位雜交術(shù)（in situ hybridization） 即核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)，檢測基因（即核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)，檢測基因（DNA片段）的有無、基因的表達(dá)活性（片段）的有無、基因的表達(dá)活性（mRNA） 原理：用帶標(biāo)記物的已知堿基順序的核酸探針原理：用帶標(biāo)記物的已知堿基順序的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)待測核酸按堿基配對原則進(jìn)行特異性與細(xì)胞內(nèi)待測核酸按堿基配對原則進(jìn)行特異

8、性原位結(jié)合（雜交），并通過對標(biāo)記物的顯示而原位結(jié)合（雜交），并通過對標(biāo)記物的顯示而獲知待測核酸的有無及相對量獲知待測核酸的有無及相對量 常用標(biāo)記物：放射性核素、地高辛常用標(biāo)記物：放射性核素、地高辛135 探針（probe） DNA或RNA片斷（一般30-40bp） 組織穿透力強 標(biāo)記：同位素（放射自顯影） 地高辛圖圖14 14 原位雜交原位雜交 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈心房鈉尿肽陽性臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈心房鈉尿肽陽性137放射自顯影術(shù)（放射自顯影術(shù)（autoradiography） 概念：通過活細(xì)胞對某種放射性物質(zhì)的特異性概念：通過活細(xì)胞對某種放射性物質(zhì)的特異性攝入，以顯示該物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布、攝入

9、，以顯示該物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布、含量和代謝過程，借以反映細(xì)胞的功能狀態(tài)含量和代謝過程，借以反映細(xì)胞的功能狀態(tài) 應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例 用用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷研究標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷研究DNA合成和細(xì)合成和細(xì)胞增殖狀態(tài)胞增殖狀態(tài) 用用125I 觀察甲狀腺濾泡內(nèi)碘化部位觀察甲狀腺濾泡內(nèi)碘化部位圖圖15 15 放射自顯影放射自顯影 示幽門部胃小凹底的干示幽門部胃小凹底的干細(xì)胞細(xì)胞 （3 3H H標(biāo)記的胸腺嘧啶核標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷標(biāo)記）苷標(biāo)記）1393H的分辨率高，但放射自顯影時間長，一般需幾周或更長時間。32P能量最大，放射自顯影時間短，需幾天，但分辨率低。35S介于兩者之間。1401. 18cm不

10、銹鋼高壓鍋或不銹鋼高壓鍋或 電爐或醫(yī)用微波爐；電爐或醫(yī)用微波爐；2. 水浴鍋水浴鍋 一一. 儀器設(shè)備儀器設(shè)備141二. 試劑 1. 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容定容0.5L。2. 0.1mol/L三乙醇胺三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺三乙醇胺 5.33ml，H20 定容定容0.4L。3. 0.5ml/L醋酸醋酸-2.5ml/L醋酸酐醋酸酐:三乙醇胺三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，濃，濃HCl 4ml，H20 定容定容0.98L，醋酸，醋酸酐酐 （用（用前加）前加）2.5ml。4. 20SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸櫞酸鈉，枸櫞酸鈉 88

11、.2g，H20 定容定容1L。1425. 100Denhardts：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容定容50ml。6.雜交液：雜交液：Formamide 5ml，20SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100Denhardts 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。7.Buffer（pH7.5）：）：0.1mol/L TrisCl，0.15mol/L NaCl。8.Buffer（pH9.5）：）：0.1mol/L TrisCl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl

12、2。9.Buffer（pH8.0）：）：10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA。 143 三三. 操作流程操作流程 第一天第一天1 1） 二甲苯于二甲苯于3737脫蠟脫蠟2 2次次, ,每次每次1515分鐘；分鐘；2 2） 無水乙醇浸泡無水乙醇浸泡2 2次，每次次，每次3 3分鐘；分鐘；3 3） 95%95%乙醇浸泡乙醇浸泡2 2次，每次次，每次3 3分鐘；分鐘；4 4） PBSPBS清洗清洗3 3分鐘；分鐘；5 5） 2%2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡焦碳酸二乙酯室溫下浸泡1010分鐘；分鐘；6 6） PBSPBS清洗清洗1010分鐘；分鐘；1.1.使用地高辛標(biāo)記使用地高辛標(biāo)記

13、的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的的核酸探針進(jìn)行石蠟切片的RNARNA原位雜交原位雜交1447 7） 加入胃蛋白酶加入胃蛋白酶25ul/ml25ul/ml，3737孵育孵育1515分鐘；分鐘；8 8） PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次3 3分鐘；分鐘；9 9） 0.2N0.2N的的HClHCl孵育孵育3030分鐘；分鐘；1010）PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次3 3分鐘；分鐘；1111）0.25%0.25%無水乙酸和無水乙酸和0.1M0.1M三乙醇胺孵育三乙醇胺孵育1010分鐘分鐘1212）PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次5 5分鐘分鐘1313）預(yù)雜交緩沖液孵育）預(yù)雜交緩

14、沖液孵育3030分鐘分鐘1414）準(zhǔn)備核酸探針混合物）準(zhǔn)備核酸探針混合物: :使用預(yù)雜交緩沖液稀使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針，釋探針，8585加熱加熱5 5分鐘分鐘, ,置于冰塊中置于冰塊中1010分鐘分鐘1515）雜交；）雜交；145第二天第二天1616）將玻片置于）將玻片置于SSCSSC中中2 2次，每次次，每次5 5分鐘以分鐘以去除封片；去除封片；1717）PBSPBS清洗清洗3 3分鐘；分鐘；1818）RNARNA酶酶A A溶液中（或溶液中（或0.1-1ng/mlPBS0.1-1ng/mlPBS中）中） 3737孵育孵育3030分鐘；分鐘；1919）PBSPBS清洗清洗5 5分鐘；分鐘；2

15、020）室溫，）室溫，2 2SSCSSC清洗清洗1010分鐘；分鐘；2121）3737，1 1SSCSSC清洗清洗1010分鐘；分鐘；2222）3737，0.50.5SSCSSC清洗清洗1010分鐘；分鐘；2323）緩沖液）緩沖液A A孵育孵育1010分鐘分鐘1462424）緩沖液）緩沖液A A（1%1%正常綿羊血清和正常綿羊血清和0.03%0.03%三重氫核三重氫核X-X-100100）孵育）孵育3030分鐘；分鐘；2525）加入抗地高辛抗體（）加入抗地高辛抗體（1/2001/200的上述緩沖液，來自的上述緩沖液，來自Boehringer MannheimBoehringer Mannhei

16、m），），3737孵育孵育3 3 小時；小時；2626）緩沖液）緩沖液A A清洗清洗2 2次，每次次，每次1010分鐘；分鐘；2727）緩沖液）緩沖液B B清洗清洗2 2次，每次次，每次5 5分鐘；分鐘；2828）制成）制成NBT/BCIPNBT/BCIP暗處保存暗處保存30-6030-60分鐘，顯微鏡下進(jìn)分鐘，顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可延長到行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可延長到1616小小時；時；2929）停止緩沖液）停止緩沖液B B的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡單的清洗；的反應(yīng)，用水進(jìn)行簡單的清洗；3030）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。）固紅，脫水以及封片進(jìn)行核的復(fù)染。147第一

17、天第一天1） 二甲苯于二甲苯于37脫蠟脫蠟2次，每次次，每次15分鐘；分鐘；2） 無水乙醇浸泡無水乙醇浸泡2次，每次次，每次5分鐘；分鐘；3） 95%乙醇浸泡乙醇浸泡2次，每次次，每次5分鐘；分鐘；4） PBS清洗清洗5分鐘；分鐘；5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘；分鐘；6） PBS清洗清洗5分鐘；分鐘；2 2、使用地高辛標(biāo)記、使用地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位的寡核苷酸探針進(jìn)行石蠟切片的原位DNADNA雜交雜交148 7 7） 加入胃蛋白酶加入胃蛋白酶25ul/ml25ul/ml，3737孵育孵育1010分鐘；分鐘；8 8） PBSPBS清洗清洗2

18、2次，每次次，每次5 5分鐘；分鐘；9 9） 0.2N0.2N的的HClHCl孵育孵育3030分鐘；分鐘；1010）PBSPBS清洗清洗2 2次，每次次，每次5 5分鐘；分鐘；1111）0.25%0.25%無水乙酸和無水乙酸和0.1M0.1M三乙醇胺孵育三乙醇胺孵育1010分鐘；分鐘；1212）PBSPBS清洗清洗5 5分鐘；分鐘；1313）預(yù)雜交緩沖液孵育）預(yù)雜交緩沖液孵育3030分鐘；分鐘；1414）準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液）準(zhǔn)備寡核苷酸探針混合物：使用預(yù)雜交緩沖液稀釋探針；稀釋探針； 1515）雜交；）雜交；149第二天第二天1616）將玻片置于）將玻片置于SSCSSC中以去除封片中以去除封片1717）室溫，）室溫，2 2SSCSSC清洗清洗1010分鐘分鐘1818）3737，1 1SSCSSC清洗清洗1010分鐘分鐘1919）3737，0.50.5SSCSSC清洗清洗1010分鐘分鐘2020）緩沖液）緩沖液A A孵育孵育1010分鐘分鐘2121）緩沖液）緩沖液A A孵育孵育3030分鐘分鐘 2222）加入抗地高辛抗體）加入抗地