微生物生理學(xué)7調(diào)節(jié)基因研究副本ppt課件

1、細(xì)菌代謝調(diào)理的層次文本細(xì)菌可以在基因表達(dá)過(guò)程的任何階段進(jìn)展調(diào)控，普通以轉(zhuǎn)錄程度上的調(diào)控為主。酶合成的調(diào)理方式酶合成誘導(dǎo)根據(jù)酶合成的方式，細(xì)胞內(nèi)的酶分為組成酶和誘導(dǎo)酶。組成酶：細(xì)胞內(nèi)以相對(duì)恒定量存在的酶，其含量不受組織、介質(zhì)的組成和生長(zhǎng)條件的影響。組成酶：通常是細(xì)胞在各種不同生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)所必需的關(guān)鍵酶類。在生長(zhǎng)的細(xì)胞中被延續(xù)的合成。它的合成僅受遺傳物質(zhì)控制即受內(nèi)因控制。誘導(dǎo)酶：在正常細(xì)胞中沒有或只需很少量存在。但是在環(huán)境中有誘導(dǎo)物普通是反響的底物存在時(shí)，微生物會(huì)因誘導(dǎo)物存在而產(chǎn)生的一種酶。它的合成既受遺傳物質(zhì)的控制，又受環(huán)境的條件的影響。誘導(dǎo)酶在微生物需求時(shí)合成，不需求時(shí)就停頓合成。這樣，既保

2、證了代謝的需求，又防止了不用要的浪費(fèi)，加強(qiáng)了微生物對(duì)環(huán)境的順應(yīng)才干。參與碳源和分解代謝的酶類普通都是誘導(dǎo)型的。酶合成阻遏細(xì)胞中有些酶的合成在通常情況下是受阻遏的，只需在環(huán)境缺乏某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，催化該物質(zhì)合成的酶類才會(huì)合成。由特定的代謝物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的濃度添加而合成速度減少的酶。參與物質(zhì)合成代謝的酶類普通都是阻遏型的?；蛘{(diào)理的根本概念反式作用因子基因表達(dá)的產(chǎn)物(蛋白質(zhì)或RNA)從合成的場(chǎng)所分散到目的場(chǎng)所而發(fā)揚(yáng)作用的過(guò)程稱為反式作用trans-acting，此基因表達(dá)產(chǎn)物被稱為反式作用因子trans-acting factor 順式作用元件順式作用元件cis-acting factor是指對(duì)基因表

3、達(dá)有調(diào)理活性的DNA序列，其活性只影響與其本身同處在一個(gè)DNA分子上的基因。順式作用元件通常不編碼蛋白質(zhì)，多位于基因旁側(cè)或內(nèi)含子中。順式作用cis-acting的概念用于任一不轉(zhuǎn)變?yōu)槿魏纹渌绞降腄NA序列，它只在原位發(fā)揚(yáng)作用，僅影響與其物理上相連的DNA序列的活性。阻抑基因表達(dá)基因活性的調(diào)控主要經(jīng)過(guò)反式作用因子通常是蛋白質(zhì)和順式作用元件通常在DNA上相互作用而實(shí)現(xiàn)。激活基因表達(dá)調(diào)理基因指參與其他基因表達(dá)調(diào)控的RNA和蛋白質(zhì)的編碼基因。調(diào)理基因編碼的調(diào)理物經(jīng)過(guò)與DNA上的特定位點(diǎn)結(jié)合而控制受調(diào)理基因的轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵。阻遏蛋白和支配基因支配基因：與啟動(dòng)子相鄰的順式作用位點(diǎn)，是阻遏蛋白的

4、靶點(diǎn)。阻遏蛋白：是基于某種調(diào)理基因所編碼的一種控制蛋白質(zhì)，在原核生物中具有抑制特定基因簇產(chǎn)生特征蛋白質(zhì)的作用。由于它能識(shí)別特定的支配基因，當(dāng)支配序列結(jié)合阻遏蛋白時(shí)會(huì)妨礙RNA聚合酶與啟動(dòng)序列的結(jié)合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前挪動(dòng)，阻遏轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)負(fù)性調(diào)理，因此可抑制與這個(gè)支配基因相聯(lián)絡(luò)的基因群，也就是支配子mRNA的合成。轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中RNA聚合酶所需求的輔助因子。轉(zhuǎn)錄因子是參與正調(diào)控的反式作用因子，在無(wú)轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄。也被稱為激活蛋白。轉(zhuǎn)錄因子通常識(shí)別位于基因上游啟動(dòng)子附近的順式作用元件。啟動(dòng)子和終止子位于轉(zhuǎn)錄單位開場(chǎng)和終了位置上的DNA序列，稱為啟

5、動(dòng)子和終子。兩者都是典型的順式作用元件，能受同一類反式作用因子RNA聚合酶的識(shí)別。構(gòu)造基因編碼蛋白質(zhì)或RNA的任何基因。構(gòu)造基因編碼大量的功能各異的蛋白質(zhì)，如組成細(xì)胞和組織的構(gòu)造蛋白和酶等。大腸桿菌乳糖支配子誘導(dǎo)物、輔阻遏物和效應(yīng)物誘導(dǎo)物：能起始酶誘導(dǎo)合成的小分子物質(zhì)，如乳糖。它與調(diào)理蛋白結(jié)合，抑制調(diào)理蛋白與支配基因的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。輔阻遏物：能阻止酶合成的小分子物質(zhì)，如氨基酸和核苷酸等。它與調(diào)理蛋白結(jié)合，促進(jìn)調(diào)理蛋白與順式作用元件的結(jié)合，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄。效應(yīng)物：誘導(dǎo)物和輔阻遏物都是小分子物質(zhì)，總稱效應(yīng)物。它們能與調(diào)理蛋白結(jié)合，并進(jìn)一步提高或降低調(diào)理蛋白與順式作用元件的結(jié)合才干。普通地酶催化

6、的底物通常用做誘導(dǎo)物，而代謝的終產(chǎn)物通常為輔阻遏物。支配子在原核生物中幾個(gè)功能相近或相關(guān)的構(gòu)造基因陳列在一同，由一個(gè)共同的啟動(dòng)子、支配基因或其他調(diào)控序列來(lái)調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄。包含這些構(gòu)造基因和控制區(qū)的整個(gè)核苷酸序列就稱為支配子。所以一個(gè)完好的支配子主要應(yīng)包括啟動(dòng)子、支配基因、構(gòu)造基因和終止子四個(gè)部分。原核生物的調(diào)控系統(tǒng)原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄程度上，根據(jù)調(diào)控機(jī)制的不同可分為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控(negative transcription regulation)和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Positive transcription regulation)。負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)調(diào)理基因編碼阻遏蛋白，阻遏蛋白阻止構(gòu)造

7、基因轉(zhuǎn)錄。其作用部位是支配基因，它與支配基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄受阻?？烧T導(dǎo)負(fù)調(diào)控系統(tǒng)阻遏蛋白不與誘導(dǎo)物結(jié)合時(shí)，阻遏蛋白與支配區(qū)相結(jié)合，構(gòu)造基因不轉(zhuǎn)錄，阻遏蛋白結(jié)合上誘導(dǎo)物時(shí)，阻遏蛋白與支配區(qū)分別，構(gòu)造基因轉(zhuǎn)錄?？勺瓒糌?fù)調(diào)控系統(tǒng)阻遏蛋白單獨(dú)無(wú)活性，當(dāng)阻遏蛋白與輔助阻遏物結(jié)合后，阻遏蛋白被激活，結(jié)合支配基因，構(gòu)造基因不轉(zhuǎn)錄。正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)理基因的產(chǎn)物是激活蛋白(activator)，激活蛋白結(jié)合與DNA的啟動(dòng)子及RNA聚合酶后，轉(zhuǎn)錄才會(huì)進(jìn)展?？烧T導(dǎo)正調(diào)控系統(tǒng)在可誘導(dǎo)正調(diào)控系統(tǒng)中，誘導(dǎo)物的存在使激活蛋白處于活性形狀，轉(zhuǎn)錄進(jìn)展?？勺瓒粽{(diào)控系統(tǒng)在可阻遏正控系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在使激活蛋

8、白處于非活性狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄不進(jìn)展。乳糖支配子的研討前期任務(wù)大腸桿菌對(duì)乳糖的利用需求誘導(dǎo)。異丙基-D-硫代半乳糖苷IPTG不能為大腸桿菌分解，但具有誘導(dǎo)效應(yīng)。野生大腸桿菌 -半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶經(jīng)乳糖誘導(dǎo)才干大量產(chǎn)生，即野生型大腸桿菌為誘導(dǎo)型。大腸桿菌對(duì)乳糖的利用至少需求三種酶，-半乳糖苷酶LacZ、-半乳糖苷透性酶LacY和-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶LacA。鄰硝基苯-D-半乳糖苷ONPG能被-半乳糖苷酶分解，產(chǎn)生黃色鄰硝基苯亞硝基酚。lacZ突變使-半乳糖苷酶構(gòu)造發(fā)生改動(dòng)，喪失活性，突變菌株檢測(cè)不到-半乳糖苷酶活性。乳糖支配子負(fù)調(diào)控的研討i 基因組成型和超阻遏型突變?cè)谟衅咸烟?/p>

9、存在時(shí)，大腸桿菌優(yōu)先利用葡萄糖，待葡萄糖耗費(fèi)盡后開場(chǎng)利用乳糖。組成型突變i-)：培育基中無(wú)乳糖存在，突變菌株也能合成大量的-半乳糖苷酶等三種酶。超阻遏型突變is：培育基中有乳糖存在，突變菌株也不能能合成大量的-半乳糖苷酶等三種酶。經(jīng)基因定位發(fā)現(xiàn)i基因與Z、Y、A所處位置不同。i基因的突變改動(dòng)了Z、Y、A的合成方式，而Z、Y、A的突變僅使各自編碼的酶蛋白失去活性，但是不影響酶的合成方式。調(diào)理基因突變與構(gòu)造基因突變比較i 基因的作用機(jī)制注：突變株的構(gòu)建是將下游構(gòu)造基因與lacI+或lacI銜接在質(zhì)粒F上，經(jīng)過(guò)F與F-菌株雜交，構(gòu)成部分二倍體。i+基因和i基因比較1,2兩項(xiàng)：不經(jīng)誘導(dǎo)i+菌株沒有酶活

10、性，而i菌株中有活性。比較3,4兩項(xiàng)：雜基因子的行為和i+菌株一樣，為誘導(dǎo)型。闡明i+對(duì)于i是顯性。從2項(xiàng)看出i基因具有多效，與Z、Y、A不同。？比較1,2兩項(xiàng)可以看出i+基因和Z+基因在對(duì)于細(xì)胞能否出現(xiàn)-半乳糖苷酶活性上具有相反作用。這闡明i基因?qū)τ诿傅暮铣善鹬麡O的作用，即阻遏酶的合成。比較3,4兩項(xiàng)還可以看到對(duì)于i和Z的關(guān)系來(lái)講，3是反式而4是順式，順反構(gòu)造沒有不同，即沒有順反位置效應(yīng)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，i+基因編碼一種阻遏物，可以抑制-半乳糖苷酶、-半乳糖苷透性酶和-半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶的合成。問題：如何驗(yàn)證上述結(jié)論？Hfr i+Z+SsT6s F I Z SrT6r采用大腸桿菌接合，將i

11、+基因引入i突變菌株中，察看酶活性變化。闡明i+基因?qū)τ赯+基因的作用必然經(jīng)過(guò)某些可分散的物質(zhì)，這些物質(zhì)由i+基因產(chǎn)生。在接合后兩個(gè)小時(shí)內(nèi)，隨菌量添加，-半乳糖苷酶活性逐漸上升，切不需誘導(dǎo)。之后，酶活性不再繼續(xù)上升。在兩小時(shí)時(shí)添加乳糖，酶活性隨時(shí)間延伸，酶活性逐漸上升。這一實(shí)驗(yàn)再次闡明i+基因編碼阻遏蛋白，在沒有乳糖存在時(shí)，抑制構(gòu)造基因的表達(dá)，而當(dāng)乳糖存在時(shí)，該蛋白失活，構(gòu)造基因得以表達(dá)。i+基因和is基因假設(shè)乳糖與阻遏蛋白相互作用，使之失活，構(gòu)造基因得以表達(dá)，那么應(yīng)該可以得到另一種調(diào)理基因的突變，它所產(chǎn)生的阻遏蛋白構(gòu)造發(fā)生了改動(dòng)，不能和乳糖接合，而一直抑制構(gòu)造基因的表達(dá)，也就是說(shuō)它是一種誘導(dǎo)

12、無(wú)效的突變型。確實(shí)分別到了這樣一種突變菌株，即超阻遏突變型，is菌株。3,4兩項(xiàng)闡明is對(duì) i+或i都是顯性。即使細(xì)胞中由于i基因存在而產(chǎn)生沒有作用的阻遏物或是由于i+的存在而產(chǎn)生能和誘導(dǎo)物結(jié)合的阻遏物，都缺乏以影響is產(chǎn)物的阻遏作用。支配基因o的研討曾經(jīng)得到一株大腸桿菌對(duì)乳糖利用的組成型突變，測(cè)得該菌株的三種構(gòu)造蛋白的酶活性均要比lacI突變低。 并發(fā)現(xiàn)該菌株的lacI沒有發(fā)生突變?；蚨ㄎ伙@示，突變位點(diǎn)與Z、Y、A相鄰，而與lacI相距較遠(yuǎn)。這闡明在大腸桿菌中還有另外一個(gè)基因參與誘導(dǎo)酶的合成。該基因便是支配基因，它的組成型突變寫作oc。大腸桿菌支配基因雜基因子酶的合成比較1,2兩項(xiàng)，可以看

13、到oc菌株和i菌株一樣為組成型，但是它的作用小于i；o基因是多效的；oc對(duì)于o是顯性。4項(xiàng)中，oc和Z+處于順式，Z+為組成型表達(dá)；5項(xiàng)中， oc和Z+處于反式， Z+為誘導(dǎo)型表達(dá)，且這時(shí) oc對(duì)于o是隱性，即存在順式顯性景象。闡明支配基因與構(gòu)造基因組成一個(gè)功能單位，即基因調(diào)控單位。o+和i+對(duì)于構(gòu)造基因Z、Y、A都起著一種阻遏作用，所不同的是i+可以作用于在構(gòu)造上沒有聯(lián)絡(luò)的構(gòu)造基因，而o+只作用于臨近位置的構(gòu)造基因。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)和分析，可得到這樣的結(jié)論：o+是i+的作用位點(diǎn)，LacI蛋白經(jīng)過(guò)與o的結(jié)合抑制構(gòu)造基因的表達(dá)。oc突變使得LacI不能與之結(jié)合，構(gòu)造基因組成型表達(dá)。表中8的結(jié)果闡明o

14、c不但不能和i+基因產(chǎn)物結(jié)合，而且也不能和is突變產(chǎn)物結(jié)合。根據(jù)這些研討結(jié)果F. Jacob和 J. monod于1961年提出了乳糖支配子模型，并開創(chuàng)了基因表達(dá)調(diào)控的研討。乳糖支配子正調(diào)控的研討葡萄糖效應(yīng)：葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代謝產(chǎn)物阻遏某些誘導(dǎo)酶體系編碼的基因轉(zhuǎn)錄的景象，又稱為降解物阻遏效應(yīng)。葡萄糖效應(yīng)研討發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生這種景象的本質(zhì)是由于葡萄糖降解物的存在使一種正控制機(jī)制不起作用的結(jié)果。降解物阻遏突變型CR這一突變菌株在含有葡萄糖和乳糖的培育液中能同時(shí)利用這兩種糖。在含有葡萄糖的培育液中野生型細(xì)菌i+ z+ y+ CR+)的-半乳糖苷酶活性相當(dāng)于在含有甘油培育液中培育時(shí)的48，阻

15、遏程度達(dá)52，對(duì)組成型細(xì)菌 i z+ y+ CR+阻遏程度也相仿。可是只需有CR突變，不論是誘導(dǎo)型還是組成型，阻遏程度就降低為0或5。同時(shí)CR突變是多效的，且無(wú)順反位置效應(yīng)。這闡明CR屬于調(diào)理基因。特殊的超阻遏突變?cè)诖竽c桿菌中曾挑選到一類只能在含有葡萄糖而不能在含有乳糖等其他須經(jīng)誘導(dǎo)才干被利用的培育液中正常生長(zhǎng)的突變型。這類突變型又可分為兩種：一種突變型只需在培育液中參與環(huán)腺苷酸cAMP便能是它的表型恢復(fù)正常，這是腺苷酸環(huán)化酶構(gòu)造基因的突變cya，它位于ilv和met之間。另一種突變型的表型不能為環(huán)腺苷酸cAMP所恢復(fù)，它位于strA和aroB 之間。研討發(fā)現(xiàn)這種突變型的細(xì)胞中短少一種能和cA

16、MP結(jié)合的蛋白，這種蛋白稱為分解代謝物激活蛋白CAP，即cAMP受體蛋白。突變型CR基因與cap基因占有同一位置，是同一基因編碼的兩種不同的突變蛋白。CAP蛋白能結(jié)合cAMP。CR對(duì)于CR+是顯性，即CR突變所編碼的蛋白在不和cAMP結(jié)合時(shí)也具有激活作用。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出cap或CR基因編碼一種激活乳糖和其他許多支配子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控蛋白，cAMP是它的效應(yīng)物。而葡萄糖的降解物那么具有抑制催化cAMP構(gòu)成的腺苷酸環(huán)化酶或促進(jìn)催化cAMP分解的磷酸二酯酶的作用。細(xì)菌調(diào)理機(jī)制研討枯草芽孢桿菌FapR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研討枯草芽孢桿菌fabHAF支配元調(diào)控區(qū)確定1. 實(shí)際分析A依賴的RNA聚合酶識(shí)別位

17、點(diǎn)，-10區(qū)和35區(qū)。有由17bp組成的反向反復(fù)序列。2. 實(shí)驗(yàn)研討突變菌株構(gòu)建amyE編碼-淀粉酶菌株JH642 amyE:pGES35lacZ表達(dá)受fabHAF支配元調(diào)控區(qū)BS3為 trpC spoOA:EmBS3 amyE:pGES35JH642為 trpC pheA1JH642 amyE:pGES35 表達(dá)分析JH642 amyE:pGES35BS3 amyE:pGES35spoOA：編碼擔(dān)任芽孢構(gòu)成的負(fù)調(diào)控因子調(diào)控區(qū)在菌體營(yíng)養(yǎng)階段表現(xiàn)活性；進(jìn)入芽孢構(gòu)成階段，活性下降。SpoOA對(duì)fabHAF支配元無(wú)調(diào)理作用。芽孢構(gòu)成與fabHAF支配元表達(dá)脂肪酸合成抑制與fabHAF支配元表達(dá)Wes

18、tern BlotCerulenin淺藍(lán)菌素，抑制細(xì)菌脂肪酸合成闡明菌體脂肪酸合成遭到抑制時(shí)，fabHAF支配元表達(dá)奈啶酮酸，抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶，對(duì) fabHAF支配元表達(dá)無(wú)影響脂肪酸合成抑制與相關(guān)基因表達(dá)采用淺藍(lán)菌素和三氯森處置野生枯草芽孢桿菌，制備總RNA，經(jīng)過(guò)Microarray分析脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)。闡明：當(dāng)脂肪酸合成代謝遭到抑制時(shí)，參與脂肪酸合成和磷脂和合成的相關(guān)基因表達(dá)添加。采用基因轉(zhuǎn)錄交融技術(shù)分析也證明了這一點(diǎn)。枯草芽孢桿菌fabHAF支配元調(diào)控蛋白確實(shí)定凝膠阻滯分析根據(jù)蛋白質(zhì)與特異DNA結(jié)合后，可使DNA在聚丙烯酰胺凝膠上的遷移率變慢的特性，而設(shè)計(jì)的一種研討蛋白質(zhì)與DNA相互

19、作用的方法。凝膠阻滯分析調(diào)控蛋白的初步確定1. PCR擴(kuò)增并制備fabHAF支配元上游300bpDNA片段一種包含17bp組成的反向反復(fù)序列，另一種不包含此片段。2. 用32P標(biāo)志上述兩片段。3. 制備枯草芽孢桿菌的無(wú)細(xì)胞抽提物。4. 無(wú)細(xì)胞抽提物與DNA溫浴，并進(jìn)展聚丙烯酰胺凝膠電泳。5. 放射性自顯影，得到結(jié)果。闡明：300bpDNA片段能與特異蛋白結(jié)合。調(diào)控蛋白的分別與純化1. 將300bpdeDNA片段與特殊的磁性小珠結(jié)合，制備親合層析填料。2. 親合層析填料與芽孢桿菌無(wú)細(xì)胞抽提物結(jié)合。3. 經(jīng)過(guò)洗脫，獲得與親合層析填料結(jié)合的蛋白。4. 經(jīng)SDS凝膠電泳分別蛋白，并經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)微量測(cè)序獲得蛋白質(zhì)N端序列。5. 根據(jù)蛋白質(zhì)N端序列在枯草芽孢桿菌基因組中搜索相應(yīng)的基因序列，得到一基因ylpC，命名為fapR。6. 根據(jù)基因序列克隆fabpR基因，并構(gòu)