熒光定量聚合酶鏈反應測定乙型肝炎病毒DNA的應用價值

1、熒光定量聚合酶鏈反應測定乙型肝炎病毒DNA的應用價值            【關(guān)鍵詞】  定量測定     【摘要】 目的 評價熒光定量PCR技術(shù)的特點與應用價值。方法 以常規(guī)PCR方法和Amplisensor熒光定量技術(shù)比較檢測了309例不同乙型肝炎病毒標志物類型患者血清中的乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）。血清學指標采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法。結(jié)果 在HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組和HBsAg、HBcA

2、b陽性組中，應用Amplisensor法測出的陽性率分別為58.54%和61.04%，分別顯著高于同組定性PCR結(jié)果（分別為31.71%和36.36%，P<0.01）;HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組的Amplisensor結(jié)果定量對數(shù)值與其他各組比較差異有非常顯著性（P<0.01），此組患者有71.33%血清中HBV-DNA在10 7 10 8 cps/ml之間;其他各組陽性患者HBV-DNA量多在10 3 10 6 cps/ml之間。結(jié)論 Amplisensor法敏感性明顯高于定性PCR，且能進行定量，能準確反映病毒的復制狀態(tài)，為臨床診斷、治療方案的篩選和療效觀察提供依

3、據(jù)。關(guān)鍵詞乙型肝炎病毒 HBV-DNA 定量測定Evaluation of fluorescence quantitative PCR in the study of hepatitis B virus Ji Zhenyu，Zhao Cuilin，Chen Hongtao，et al. Henan Institute of Medical Sciences，Medical College of Zhengzhou University，Zhengzhou450052. 【Abstract】 Objective To evaluate the charac

4、teristics and the significance of fluorescence quantitative PCR test.Methods Hepatitis B virus DNA in309cases with different type of HBV markers were detected comparatively by routine PCR and Amplisensor assay.HBV markers were detected by ELISA.Results In the group of HBsAg，HBeAb，HBcAb positive and

5、HBsAg，HBcAb positive，the Amplisensor positive rates were58.54%and61.04%respectively，significantly higher than routine PCR positive rates in the same group（31.71%and36.36%，P<0.01）;The Logcopies in HBsAg，HBeAg，HBcAb positive group were also significantly higher than that in other groups（P<0.01），

6、with71.33%cases reading between10 7 cps/ml and10 8 cps/ml.HBV DNA copies in other groups were between10 3 cps/ml and10 6 cps/ml.Conclusion The sensitivity of Amplisensor assay was higher than that of routine PCR.Amplisensor can provide quantitative results，which reflect the state of HBV amplificatio

7、n and support another means for further monitoring of HBV infection.Key words hepatitis B virus HBV DNA quantitative test 乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）是反映乙型肝炎病毒（HBV）復制的最可靠指標。以往檢測HBV-DNA方法主要為斑點雜交（Dot-blot）和定性PCR方法，但由于Dot-blot的低敏感性，定性PCR的假陽性及電泳產(chǎn)物染色劑溴乙錠的毒性作用而限制了在臨床方面的應用，而且以上兩種方法無法給出臨床所需要的定量結(jié)果。近年來熒光定量技術(shù)在臨床上有了

8、較普遍的應用，但目前還沒有統(tǒng)一的技術(shù)標準 1 。本文應用常規(guī)定性PCR和Amplisensor熒光定量技術(shù)檢測了309例臨床血清標本，并探討其應用價值，報告如下。1 材料與方法1.1 研究對象 309例病人為2001年1月2003年5月來本室門診部應診的患者，應用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法排除甲型、丙型和戊型肝炎。對性別年齡無特殊要求。1.2 儀器 使用美國Biotronics公司AG-9600Minilizer。1.3 ELISA 試劑由濰坊3V公司提供。1.4 定性PCR 引物序列為:P1（1679F）:5-GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GGC A-3，P2（2

9、254R）:5-GAA GAT GAG GCA TAG CAG GAT-3，由美國Scripps研究所合成。Taq酶購自華美生物工程公司。樣品提取及循環(huán)擴增方法見文獻 2 。1.5 Amplisensor熒光定量分析 不對稱擴增引物為P15-TGC TCG TGT TAC AGG CGG GGT-3，P25-GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG-3，由美國Biotronics公司提供，擴增產(chǎn)物為241bp。熒光信號引物為:5-TCG CTG GAA GTG TCT GCG GCG T-3。檢測方法為:（1）血清標本HBV-DNA提取:取患者血清100l，與200l的S

10、TG Buffer混合，80溫育10min，冷卻至室溫后，加300l預冷（4）的異戊醇，-30放置30min后，15000轉(zhuǎn)/min離心10min，去上清，加100l KW Buffer洗一次，15000轉(zhuǎn)/min離心5min，徹底去上清后風干，用50l樣品稀釋液再溶解備用。（2）制備模板HBV-DNA標準:用稀釋液按10倍比例稀釋HBV-DNA標準，制備成1×10 8 ，1×10 7 ，1×10 6 ，1×10 5 ，1×10 4 ，1×10 3 拷貝數(shù)/ml（cps/ml）的標準系列。（3）不對稱擴增:于10l的不對稱擴增反應液中

11、加入5l提取的樣品液，并設(shè)一陰性對照孔，一峰值孔，六個標準孔。90預變性1min后，按9435s，6035s，7240s，循環(huán)20次，測定基礎(chǔ)熒光讀數(shù)。以后每2次循環(huán)測定一次熒光值。當最后一個標準出現(xiàn)熒光信號衰減后即可終止反應。所有熒光信號衰減數(shù)據(jù)均用ASAP軟件分析，<1×103 cps/ml者判為陰性。1.6 統(tǒng)計學方法 卡方檢驗。因計量資料為非正態(tài)分布，故做對數(shù)變換后采用方差分析。陰性結(jié)果不參與統(tǒng)計。2 結(jié)果2.1 不同標志物類型患者定性PCR和Amplisensor分析結(jié) 果 見表1。2.2 不同標志物類型患者HBV-DNA量的分布 人為將HBV-DNA的量分成<

12、10 3 ，10 3 104 ，10 5 10 6 ，10 7 10 8 ，>10 9 組（單位:cps/ml），并計算各組百分率，以方便觀察分布狀態(tài)。HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者HBV-DNA量多在10 7 10 8 cps/ml，占71.33%。HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組和HBsAg、HBcAb陽性組患者（HBV-NDA陽性患者）血清中的HBV-DNA量多在10 3 10 6 cps/ml之間，分別占50.00%和46.76%。見表2。表1 309例患者定性PCR、ELISA和Amplisensor定量分析結(jié)果略表2 不同標志物類型患者HBV-DNA量的

13、分布 （略）3 討論由表1可見，乙型肝炎患者血清內(nèi)HBV-DNA的負荷量與乙型肝炎病毒標志物模式有關(guān)。在HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組，Amplisensor方法的檢出率高達98.67%，此組有71.33%的患者血清內(nèi)HBV-DNA含量在10 7 10 8 cps/ml之間，其定量結(jié)果對數(shù)值為4.94±1.04，顯著高于其他兩組（P<0.01）。雖然本組定性PCR和Amplisensor兩種方法的檢出率無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但在HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組和HBsAg、HBcAb陽性組，Amplisensor方法的檢出陽性率分別顯著高于定性P

14、CR方法（P<0.01），提示使用Amplisensor方法可提高HBV-DNA檢出的敏感性。HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組和HBsAg、HBcAb陽性組患者血清內(nèi)HBV-DNA含量在10 410 8 cps/ml之間不等，其均數(shù)標準差很大，不但證實了HBeAg陰性患者可存在高水平的HBV-DNA復制，而且提示病毒的復制程度還與患者個體狀態(tài)有關(guān)。有報道認為高病毒負荷量的HBeAg陰性患者多與HBV-DNA前C區(qū)基因變異有關(guān) 3 ，尤其是HBV-DNA前C區(qū)1896位點的GA突變，使編碼色氨酸的密碼子TGG突變?yōu)榻K止密碼子TAG，阻斷了HBeAg的合成。位于X讀碼區(qū)的C啟動子也可

15、發(fā)生突變，致使HBeAg合成分泌減少，但病毒復制仍很活躍 4 。應用Amplisensor 定量分析技術(shù)可動態(tài)檢測患者血清中病毒的量的變化，從而為診斷和治療提供客觀依據(jù)。Amplisensor定量分析技術(shù)的原理已有很多報道闡明 5，6 ，其關(guān)鍵部分是在反應中使用了不對稱引物和熒光信號引物，兩條不同濃度的引物可使第一輪的擴增產(chǎn)生過多的一條鏈。熒光信號引物則是一條穩(wěn)定的短雙鏈結(jié)構(gòu)，其中一條鏈可做為引物引導DNA新鏈的合成。當這條鏈參與合成反應成為新DNA鏈的一部分時，原有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞，雙鏈打開，兩條鏈間的能量傳遞途徑被破壞，熒光信號就會消失。比較樣本孔熒光信號衰減程度和已知濃度的標準孔熒光信號衰減程度，經(jīng)專用ASAP軟件分析可方便得出初始模板DNA的含量。由于使用具有穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)的熒光信號引物做為內(nèi)探針，因而提高了Amplise