聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在石蠟包埋組織中的應(yīng)用

1、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在石蠟包埋組織中的應(yīng)用    PCR是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外將特異性目的DNA片段序列進(jìn)行高效擴(kuò)增的分子生物學(xué)新技術(shù)。自八十年代由美國Muilis發(fā)明這項(xiàng)技術(shù)以來，由于具有快速、敏感、特異及高效的特點(diǎn)，得以迅速推廣，并從這一分子生物學(xué)基本技術(shù)擴(kuò)展出一系列分子生物學(xué)研究方法            PCR是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外將特異性目的DNA片段序列進(jìn)行高效擴(kuò)增的分子生物學(xué)新技術(shù)。自八十年代由美國Muilis發(fā)

2、明這項(xiàng)技術(shù)以來，由于具有快速、敏感、特異及高效的特點(diǎn)，得以迅速推廣，并從這一分子生物學(xué)基本技術(shù)擴(kuò)展出一系列分子生物學(xué)研究方法。PCR擴(kuò)增所需的模板DNA來源，也由從新鮮組織細(xì)胞、冰凍組織中提取到可從石蠟包埋組織中獲得。          一、石蠟包埋組織PCR的意義：          1、對疑難病例的診斷和鑒別診斷：   由于PCR檢測的高敏感性和高特異性，如用于IgH/TCR基因重排時(shí)敏感 性達(dá)10-4

3、 10-6 ，一些衍生的PCR方法還可進(jìn)一步提高敏感性，因此，是提高診斷率的一個重要輔助手段。          2、 結(jié)束了DNA研究依賴于新鮮、冰凍組織和細(xì)胞的歷史，可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要。          3、 用于回顧性研究：大量存檔的石蠟包埋組織可充分利用，對腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行探討。         

4、; 4、對疾病的形態(tài)學(xué)、免疫表型和基因改變作相關(guān)性分析。          二、PCR對石蠟包埋組織的要求：           組織固定和石蠟包埋制片過程與免疫組化要求基本相同，但需注意：               1、含血多的組織先用生理鹽水洗后再固定。 

5、0;             2、壞死組織必須去除。               3、甲醛固定時(shí)間越長對DNA破壞越嚴(yán)重，因此固定時(shí)間最好不超過24小時(shí)。               4、避免交叉污染

6、，組織切片放入無菌AP管或撈于干凈的載玻片上。              5、切片應(yīng)具有一定的厚度，一般約5-10微米。          三、石蠟包埋組織DNA的提取方法：           1、酚抽提法：      

7、0;       酚抽提法是DNA的常規(guī)提取方法，比較穩(wěn)定。a石蠟包埋組織切片（5-7微米）1-5片放入1.5毫升無菌AP管中。 b、加二甲苯1毫升脫蠟10分，離心10000r/5分，棄上清，重復(fù)二次。 c、加無水乙醇1毫升洗二甲苯5分，離心6000r/5分，棄上清，重復(fù)二次。d 、將AP管蓋打開，放入37恆溫箱內(nèi)干燥組織0.5小時(shí)，取出放室溫，使乙醇盡量揮發(fā)。e 、加消化液0.5毫升混勻，3750水浴消化過夜，至組織完全消化為止。       

8、                             PH8.0  10mM Tris-HCL Buffer                

9、60;                                                  &#

10、160;       1mM EDTA          消化液成分：  10%SDS 終濃度25微克/毫升                           

11、0;        20mg/ml PK 終濃度500微克/毫升               f 、組織消化后取出AP管，離心12000r/10分，小心吸出上清（DNA）于另一AP管內(nèi)，棄沉淀。           g 、在上清內(nèi)加1倍體積飽和酚輕輕顛倒混勻，離心6000r/5分，此時(shí)液體分為三層，從上至下為

12、：上清（DNA）-蛋白質(zhì)-酚，小心吸出上清至另一AP 管中。                                  h 、加1倍體積酚/氯仿（1：1）混合液，輕輕顛倒混勻，離心6000r/5分，此時(shí)管內(nèi)液體分為兩層，上清（DNA），下層有機(jī)試劑（細(xì)胞密度大，蛋白質(zhì)含量

13、豐富的組織，有時(shí)中間層也出現(xiàn)少量的蛋白質(zhì)），小心吸出上清至另一AP管中。           i 、 加1倍體積氯仿/異戊醇（24：1）混合液，輕輕顛倒混勻，離心6000r/5分,此時(shí)管內(nèi)液體分為兩層，上清（DNA），下層有機(jī)試劑，小心吸出上清液至另一AP管中。           j 、 DNA沉淀：加1/10體積的PH5.2、3M/L NaAC緩沖液，混勻，再加2倍體積-20預(yù)冷無水乙醇，混勻

14、后放-20 2小時(shí)以上或過夜。           k、 離心12000r/15分，棄上清，管內(nèi)沉淀即為DNA。           L、 加1倍體積75%乙醇洗沉淀，室溫放5分，離心12000r/15分，棄上清，沉淀室溫自然晾干。           m、 加無菌去離子水（或TE液）適量溶解DNA

15、，放4 冰箱保存待用。         2、粗提法：（粗提+刮片法）           a、石蠟包埋組織切片（57微米）15片，貼于干凈的載玻片上，烤干。           b、二甲苯脫蠟10分× 3次。        

16、60;  c、無水乙醇洗二甲苯5分× 3次，切片自然干燥。           d 、 用無菌刀片，將脫蠟后的組織從玻片上刮下，收集于無菌AP管中。           e、加消化液0.1ml，輕輕混勻，在3750水浴中消化過夜。            

17、60;                          PH8.0  50mM  Tris-Hcl  Buffer             消化液成分：  10mM  EDTA 

18、                                                  

19、                                                   

20、;          0.5%（V/V) Tween-20                                      

21、60;                                                  &#

22、160;            100- 200微克 PK           f 、 待組織完全消化后，將AP管移入沸水中煮10分，滅活蛋白酶K的活性。           g、 離心10000r/10分，取上清即為DNA模板，放4冰箱備用。     

23、60;    兩種提取方法的比較：         酚抽提法： 有機(jī)試劑的多次抽提，可消除石蠟包埋組織因固定所造成的理化性質(zhì)的改變。亦可消除一些DNA聚合酶的抑制因素，故DNA純度較高、穩(wěn)定、重復(fù)性好，適用范圍廣。不足之處是步驟較多，DNA丟失嚴(yán)重，不適于少量標(biāo)本的DNA提取。         粗提與刮片法： 快速，省去了多次離心的繁雜步驟，減少了DNA的丟失。不僅適用于未染色的組織切片，而且還適用于經(jīng)HE

24、、免疫組化染色的組織切片。最突出的優(yōu)點(diǎn)是可在光鏡下選擇性刮取所需組織，去除抑制PCR反應(yīng)的出血、壞死等組織，提高陽性檢出率，為臨床基因檢測和科研工作      密切結(jié)合及同步觀察提供了一個較為實(shí)用的方法。適用于少量標(biāo)本的DNA提取。不足之處是產(chǎn)品較粗，重復(fù)性較差，不適于對DNA質(zhì)量要求高的檢測技術(shù)（如DNA測序）。                   

25、60;       選擇何種方法提取DNA，主要看實(shí)驗(yàn)的目的。PCR擴(kuò)增對DNA模板要求不高，粗品也能擴(kuò)增產(chǎn)生大量特異性DNA拷貝。但是為了提高PCR敏感性和可重復(fù)性，模板DNA盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR反應(yīng)的成分。             四、DNA純度的測定：           1、分光光度法測定DNA含量： 

26、;               利用分光光度法測定DNA中堿基吸收紫外輻射的量。DNA最大吸收波長為260nm，蛋白質(zhì)為280nm。根據(jù)260/280的讀數(shù)比值估計(jì)DNA的純度。260/280比值在1. 60-1. 80之間較好，比值過高（ 1.85）可能有RNA污染，比值過低（1.60）可能有蛋白質(zhì)污染。一個OD值相當(dāng)于大約50g/ml雙鏈DNA。         

27、  2、溴化乙啶（EB）熒光法：                DNA含量 250ng/ml或DNA樣品中雜質(zhì)含量較高時(shí)用。EB可嵌入DNA 分子，在紫外光下產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，以此估計(jì)DNA含量。         五、提高DNA質(zhì)量的方法：        &#

28、160;  1、組織的固定和包埋：10%中性甲醛固定時(shí)間不應(yīng)太長，一般在12-24小時(shí)之內(nèi)，包埋過程避免溫度過高，大約62 左右。           2、石蠟包埋組織塊的選擇：石蠟切片結(jié)構(gòu)不清，有大片出血的蠟塊不用；有明顯壞死存在的蠟塊最好不用，或切去壞死部分再用；盡可能選用近期的蠟塊。           3、改善提取方法：需要根據(jù)組織類型調(diào)整消化液中各組分的濃度和消化時(shí)間。

29、0;          4、避免DNA機(jī)械損傷：切片不能太薄，操作過程要輕，避免過多移管，以防人為的DNA剪切。         六、DNA的儲存：               提取或純化的DNA，最好用TE buffer溶解（也可用無菌去離子水溶解），4 保存待用。短期內(nèi)不用可放-20凍

30、存，DNA溶液可保存6個月，凍干后保存期1-2年，-70 能保存5年以上。長期保存時(shí)，可在DNA樣品中加入1滴 氯仿避免細(xì)菌和/或核酸酶的污染。切忌反復(fù)凍融，以免DNA降解。             七、PCR原理及步驟：              聚合酶鏈反應(yīng)是基于體外模擬DNA的天然復(fù)制過程，在有模板DNA、引物 和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴D

31、NA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。         原理：      靶序列         -  DNA模板                         - &#

32、160;                                                  &

33、#160;                            -   變性    在高溫下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃裕姿岫ユI斷裂成兩條單鏈DNA           &

34、#160;                            -                      

35、0;                                                 -  退火  在低溫（45-

36、67 C）下，兩條人工                                       合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈       

37、60;                                DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈              -   

38、60;                                            -  延伸    在TaqDNA聚合酶催化下，

39、以                                           引物3端為合成起點(diǎn)，以單核      &#

40、160;                                   苷酸為原料，沿模板5，3，         -    

41、0;     方向延伸合成DNA新鏈。                                           

42、60;                           一個PCR循環(huán)          每一個循環(huán)產(chǎn)生的DNA均為下次循環(huán)的模板，經(jīng)2535個循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109 倍以上，實(shí)際106 107倍。     

43、0;       以PCR檢測免疫球蛋白重鏈（IgH）和T細(xì)胞受體（TCR）基因重排為例，簡述PCR擴(kuò)增過程。          原理：              淋巴細(xì)胞在分化發(fā)育過程中，TCR和IgH編碼基因發(fā)生重排，即可變區(qū)（V）與結(jié)合區(qū)（J）之間兩個距離很遠(yuǎn)的片段重新排列在一起，形成新片段。這些新片段是每個淋巴

44、細(xì)胞克隆特有的標(biāo)記。用V區(qū)相對保守的寡核苷酸序列作引物一端，J區(qū)的一段序列作引物另一端進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果：正常淋巴細(xì)胞的重排過程具有隨機(jī)性和多態(tài)性，擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳圖像呈彌漫分布，無明顯重排帶；而淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤由于某一階段發(fā)生突變呈克隆性增殖的瘤細(xì)胞為同一基因結(jié)構(gòu)，形成單克隆性重排，擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳呈一狹窄的重排帶，這 就成為淋巴系統(tǒng)疾病基因診斷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。                1、PCR反應(yīng)體系（25微升體積）：    

45、;                      100mM/L  Tris-HCl  PH8.0                       

46、  15mM/L  KCl       PCR  buffer       15mM/L  MgCl                          0.01% (w/v)  明膠

47、0;                                                 

48、0;            dNTP (1mM/L)       引物 （20M/L）       Taq DNA 聚合酶 （ 2u/l  ）       模板DNA   ( 50ng1g)       無菌去離子水 &

49、#160; （補(bǔ)足體積）                     2、PCR反應(yīng)條件：  IgH：采用一對半（三條）引物兩輪擴(kuò)增，也稱半巢式擴(kuò)增。        第一輪引物： FR2 A、  LJH 或 FR3 A、 LJH        

50、            循環(huán)參數(shù)：  預(yù)變性 95 3分                                變性   94 40秒

51、0;                               退火   62 50秒                

52、                延伸   72 40秒                                &

53、#160;   30個循環(huán)        第二輪： 將第一輪產(chǎn)物以1：50-1：1000無菌去離子水稀釋后作模板。引物： FR 2A、 VLJH 或 FR 3A、 VLJH                    循環(huán)參數(shù)： 變性  94 40秒     

54、60;                         退火  6050秒                       

55、        延伸  72 40秒                         25個循環(huán)后，再延伸72 10分。              &

56、#160;  TCR：采用8條引物混合單輪擴(kuò)增。       引物： V2、V3、V4、V8、V9、JGT12、JGT3、JGT4                            循環(huán)參數(shù)： 預(yù)變性 94 6分   

57、0;                            變性   94 1分                   &

58、#160;            退火   55 1分                                延伸   72 1分&

59、#160;                        40個循環(huán)后，再延伸72 10分。               八、PCR擴(kuò)增中須注意的問題：       &#

60、160;     1、設(shè)相應(yīng)的對照：    陽性對照：瘤細(xì)胞株或已知有單克隆性重排的淋巴瘤。    陰性對照：淋巴結(jié)反應(yīng)性增生或無模板的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。             2、注意PCR擴(kuò)增過程中的污染：     器皿和試劑經(jīng)高壓消毒，試劑小量分裝，操作時(shí)戴手套，最好在超凈臺內(nèi)工作。    &

61、#160;        3、Taq DNA聚合酶雖具耐熱性，但長時(shí)間高溫也會使酶活力下降，應(yīng)盡量減少高溫加熱時(shí)間。             4、Taq酶對Mg2+ 十分敏感，是Mg2+ 的依賴酶。反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及buffer中的EDTA均能與Mg2+ 結(jié)合，影響自由Mg2+濃度。反應(yīng)體系中這些試劑的用量，尤其是模板DNA用量，要保持相對恒定。   

62、60;         5、PCR是一個復(fù)雜的體系，許多組分和條件互相制約，改變某一條件會涉及其它因素，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的最佳條件。應(yīng)在通用條件基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)適當(dāng)調(diào)整，以確定自己的最適條件。          九、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析：      PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度由引物間距離決定。產(chǎn)物長度不同，電泳過程中泳動速度不同，將其與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker對照，就能確定出產(chǎn)物的bp大小

63、。             1、聚丙烯酰胺凝膠電泳：    濃度視待分析產(chǎn)物bp大小而定，EB（溴化乙啶）染色，紫外透射儀下觀察特定區(qū)域條帶。也可用銀染色，肉眼觀察結(jié)果。此法敏感性高，主要用于5500bp的小片段產(chǎn)物。             2、瓊脂糖凝膠電泳：     

64、60;      視待測產(chǎn)物bp大小而定，EB染色，紫外透射儀下觀察特定區(qū)域條帶。           此法敏感性稍低，主要用于200bp50kb的大片段產(chǎn)物。        陽性標(biāo)準(zhǔn)：a、陽性、陰性對照結(jié)果正常。              

65、;    b、電泳條帶清晰，寬度在2mm以內(nèi)。                  c、片段大小與引物特定的范圍相符。                  d、特異性陽性條帶亮度大于非特異性帶。   &#

66、160;              十、常用試劑的配制：           1、20mg/ml 蛋白酶K （PK）：                 稱20mg PK，無菌去離子水1ml溶解，分裝，-20 凍存。

67、60;          2、PH8.0  TE液：              儲存液：                 1M Tris-HCl： 稱Tris-堿12.1g，溶于去離子水，濃鹽酸調(diào)PH至 8.0

68、,                定溶100ml，高壓滅菌。0. 5M EDTA：稱乙二胺四乙酸二鈉18.6g，溶于去離子水，10N NaOH調(diào)PH至8.0，定容100ml   ，高壓滅菌。                   &

69、#160;                                                  

70、     應(yīng)用液：                   A：   PH8.0    0.01M  TE                              1M  Tris-HCl 1ml.  0.5M  EDTA 0.2ml.加去離子水9