肺癌外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達的臨床意義

1、肺癌外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達的臨床意義 作者：仲崇俊，蔣庚西，陶國華，王永旺【摘要】 目的：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測肺癌患者腫瘤組織和外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達，探討其作為肺癌微轉(zhuǎn)移檢測分子標志物的可行性。方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測40例非小細胞肺癌組織和15例肺良性病變組織中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達；檢測40例肺癌患者外周血中靶基因的表達，并以15例良性肺疾病患者和10名健康人外周血作為對照。結(jié)果：40例肺癌患者病理組織中EGFR mR

2、NA、SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達率為77.5%（31/40）、100%（40/40）、100%（40/40），外周血中EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達陽性率分別為55.0%（22/40）、52.5%（21/40）和57.5%（23/40）；對照組中15例肺良性病變患者病理組織中EGFR mRNA表達率為13.3%（2/15），無SP-D mRNA和LUNX mRNA表達，15例肺良性病變患者和10名健康人的外周血中無EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA表達。結(jié)論：EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA作為

3、檢測肺癌組織及肺癌外周血微轉(zhuǎn)移的分子標志物具有良好的敏感度和特異性；三者表達與肺癌TNM分期、組織學類型和癌細胞分化程度關(guān)系密切。 【關(guān)鍵詞】 肺腫瘤；微轉(zhuǎn)移；表皮生長因子受體；肺表面活性蛋白D；肺特異性蛋白X肺癌細胞在術(shù)前、術(shù)中脫離原發(fā)灶，以非常少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、血液、骨髓或遠處器官中，常規(guī)臨床檢查難以發(fā)現(xiàn)，此為腫瘤的微轉(zhuǎn)移。RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，使檢測外周血中微量癌細胞成為可能。但目前在肺癌微轉(zhuǎn)移的檢測中，缺少公認的特異的分子標記物1。本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測了40例非小細胞肺癌（NSCLC）患者外周血中EGFR、SP-D和LUNX的表達，分析其與病理生理

4、學特征的關(guān)系，以探討靶基因作為診斷肺癌微轉(zhuǎn)移的價值。1 材料和方法1.1 一般資料 病例 40例NSCLC患者均來源于本院胸心外科手術(shù)患者，病理學診斷明確，且臨床影像學檢查未見遠處轉(zhuǎn)移，其中，55歲31例，55歲9例，男30例，女10例，腺癌22例，鱗癌18例；另選15例肺部良性疾病患者（包括良性腫瘤、肺大泡、支氣管擴張等）及10名健康人作為對照組。1.2 試劑與引物設(shè)計 參照GenBank，采用Primer Premier5引物設(shè)計軟件設(shè)計EGFR、SP-D和LUNX基因內(nèi)外引物，EGFR上游:5-CATCTCCGAAAGCCAACA-3，EGFR下游:5-CGACGGTCCTCCAAGTA

5、G-3，擴增產(chǎn)物長度244bp；SPD上游:5-AAAGTGTCGGGGAGAAGA-3，SPD下游:5-TCAGTCATGCTCAGGAAA-3，擴增產(chǎn)物長度178bp；LUNX上游:5-GGGCATTCTGGAAAACCT-3，LUNX下游:5-GGCGTATTCACTTGGAGC-3，擴增產(chǎn)物長度237bp；內(nèi)參引物為GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）以檢測RNA的完整性，GAPDH上游:5-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3，GAPDH下游:AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3，擴增產(chǎn)物長度306bp，由上海生工合成。1.3 標本的收集與總RNA抽提 對

6、所有肺癌患者于治療前抽取新鮮肝素抗凝血5ml，用淋巴細胞分離液進行有核細胞的分離，Trizol試劑一步法抽提總RNA，另對手術(shù)切除腫瘤于手術(shù)室內(nèi)切取小塊新鮮腫瘤組織液氮速凍保存，取約50100mg行總RNA的抽提。1.4 RNA鑒定 對所抽提的總RNA行紫外分光光度定量，并行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。cDNA第一鏈合成取樣品總RNA約2g加入20l反應(yīng)體系中，按照試劑盒提供的條件進行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴增EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA與GAPDH(內(nèi)參)。按照文獻報道方法46，結(jié)合實驗優(yōu)化條件進行。具體反應(yīng)條件分列如下：EGFR、SP-D、LUNX PCR反應(yīng)體系25l，

7、其中cDNA 2l,10PCR buffer 2.5l,TaqDNA 5U/l 聚合酶0.2l,2mmol/L dNTPmix 2.5l,20mmol/L MgCl2 1.5l, EGFR上、下游引物(10pm/L)各1l,加入適量的雙蒸水，使總體積達25l。反應(yīng)條件:95C預(yù)變性5min, 95C變性45s， 50C 45s， 72C 45s，共45個循環(huán)，在第15個循環(huán)末時加入GAPDH上、下游引物(10pmol/L)各1l，最后72C延伸7min。PCR產(chǎn)物分析 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在四星凝膠成像系統(tǒng)下拍照和分析。1.5 統(tǒng)計學方法 使用STATA 7.0統(tǒng)計軟件對資料進行分析，相關(guān)

8、數(shù)據(jù)采用2檢驗和Fisher確切概率法進行處理，P0.05、P0.01為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 總RNA鑒定 實驗中抽提的總RNA OD260/280值在1.761.97之間，外周血抽提總RNA約50100g，電泳后EB染色可見28s,18s亮帶。2.2 EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA檢測結(jié)果 NSCLC組織和肺良性病變組織檢測結(jié)果見表1。肺癌組織中，EGFR mRNA與SP-D mRNA、LUNX mRNA的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。外周血肺癌與對照組EGFR mRNA、SP-D mRNA與LUNX mRNA檢測結(jié)果見表2。由表2可見EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3項指標在肺癌組中的表達陽性率有差異，但不具有統(tǒng)計學意義(P=0.904)。在同一分期中，EGFR mRNA、SP-D mRNA、LUNX mRNA 3項指標的表達陽性率有差異，但不具有統(tǒng)計學意義（期：P=0.632；期：P=0.924；期：P=0.120）。在同一病理分型中，EGFR mRNA、SP-D mRNA