鼻咽癌組織中DNA聚合酶β基因突變

1、鼻咽癌組織中DNA聚合酶基因突變                作者：鄭紅，李明善，趙國強, 董子明    【摘要】  目的 研究鼻咽癌中是否存在DNA聚合酶(DNA polymerase, pol)的突變及變異情況。方法 采用RTPCR法（逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶鏈反應(yīng)）、PCRSSCP（聚合酶鏈單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析）、DNA序列分析法對26例鼻咽癌組織進行pol基因突變研究。結(jié)果 鼻咽癌組織中存在po

2、l基因突變,且基因突變率與癌組織的病理分級有關(guān), 高分化（G1）、中度分化（G2）、低分化及未分化（G3）鼻咽癌組織中pol基因突變率分別為12.5%(2/16)、21.4%(3/14)、80%(8/10)。G1與G2 比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.01) , G1與G3 、G2與G3比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.005)。測序結(jié)果表明, pol基因的第454位核苷酸由T變?yōu)镃，其氨基酸變異為第114位氨基酸由Phe變?yōu)镾er；第466位核苷酸由G變?yōu)锳，其氨基酸變異為第118位氨基酸由Gly變?yōu)镚lu；第148位核苷酸由A變?yōu)镚，其氨基酸變異為第28位氨基酸由Asn變?yōu)镾e

3、r。結(jié)論 發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌組織中存在多種形式的pol突變，導致氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)的改變，可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  DNA聚合酶；鼻咽癌；基因突變 Abstract：Objective   To study DNA polymerase(pol) gene mutation in human nasopharyngeal cancer.Methods  40 cases of nasopharyngeal carcinoma (NPC) tissues were collected to study DNA polgene mutatio

4、n with PTPCR, PCRSSCP and DNA sequence analyzing technique, the 40 cases of NPC were divided into three groups according to pathology differentiation,16 cases of grade (G1) ,14 cases of grade (G2) ,10 cases of grade (G3).Results  Polgene mutation was detected by SSCP in 13 of 40 NPC tissues (wi

5、th mutation rate 32.5%) and Many kinds of mutation were found by DNA sequencing, the mutation rate of G1, G2, G3 was 12.5%, 21.4%, 80% respectively. The sequencing of the PCR product showed an T to C chang at nucleotide 454 ,which resulted in a substitution of the amino acid from Phe to Ser at site

6、114; 466nt GA resulting in GlyGlu at 118 site ;148nt AG resulting in AsnSer at 28 site.Conclusion  The study proves there is pol alternation in human nasopharyngeal carcinoma, this induces change in amino acid and spatial structure. The mutation rate in low differentiated cancer was significant

7、ly higher than those in moderate and high ones. These mutations may be related with the development of NPC. Key words：DNA pol; Nasopharyngeal carcinoma; Gene mutation 0  引言   DNA聚合酶（DNA polymerase , pol）是一種修復酶，在哺乳動物細胞中參與DNA的合成和修復的某些過程1,2。其缺陷與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在人類多種腫瘤中存在pol突變36  ，然而有關(guān)鼻咽癌中

8、有無pol基因突變尚未見報道。我們采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、DNA序列測定法對40例鼻咽癌組織進行了pol基因突變研究。 1  資料和方法 1.1  研究對象  鼻咽癌標本40例，取自河南省鄭州大學第一附屬醫(yī)院和河南大學附屬淮河醫(yī)院，病理證實均為鱗狀上皮細胞癌，高分化（G1）16例，中度分化（G2）14例，低分化及未分化（G3）10例。病人均為北方人(河南29例、山東8例、山西3例），男31例，女9例，年齡2876歲，平均57歲。 1.2  方法  參考GenBank的M13740序列設(shè)計出7對SSCP引物，1對完整的pol全

9、基因序列引物。按照RNA提取試劑盒步驟進行提取總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行七區(qū)段擴增；取PCR擴增產(chǎn)物與變性載樣緩沖液混勻，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。取下凝膠，銀染后照相記錄并分析SSCP結(jié)果；PCR產(chǎn)物與pGEMT載體連接，轉(zhuǎn)化入JM109細胞中進行PCR產(chǎn)物的克??；用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，利用熒光標記法ABI 377測序儀雙向測定DNA序列（由上海生工公司完成）。所得結(jié)果利用DNASIS軟件與GenBank中查到的DNA聚合酶基因進行同源比較和分析。1.3  統(tǒng)計學分析  采用2檢驗來比較不同分化程度鼻咽癌組織突變率的差異。2  結(jié)果 2.1

10、0; pol  PCRSSCP結(jié)果  40例鼻咽癌組織標本中有13例pol基因SSCP異常，突變率為32.5%，見圖1。 A、C、D、E： SSCP正常；B： SSCP異常 圖1  pol  PCRSSCP結(jié)果（略） 2.2  測序結(jié)果比較峰值圖  見圖2。 圖2  pol基因454位TC, 466位GA變異峰值圖（略） 2.3  pol基因各變異位點對應(yīng)的氨基酸變異情況  見表1。 表1  NPC13 pol各變異位點對應(yīng)的氨基酸變異情況（略） NPC13為隨機抽取的pol PCRSSCP異常

11、的標本 2.4  鼻咽癌組織病理分級與pol基因突變統(tǒng)計學結(jié)果  鼻咽癌組織中G1、G2 、G3 的POLB 基因突變率分別為12.5%(2/16)、21.4%(3/14)、80%(8/10)。G1與G3 、G2與G3分別比較,差異均有統(tǒng)計學意義(2=11.82, P<0.005；2=8.07, P<0.005)；G1與G2 比較,差異無統(tǒng)計學意義(2=0.43, 0.50 3  討論    DNA聚合酶是一重要的DNA修復酶，該酶在哺乳類動物細胞的同源性以及在結(jié)構(gòu)進化中的高度保守性說明它在生命活動中起著重要作用7。自從重

12、組全DNA技術(shù)克隆出了pol的cDNA以后，它的生物學功能越來越受到人們的關(guān)注，有人稱其為生物進化過程的“看家酶”，其缺陷與一些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。有報道在人類結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等都有pol基因突變，尤以結(jié)直腸癌突變率最高，可達80%以上。然而有關(guān)鼻咽癌中有無DNA聚合酶基因突變尚未見報道。由于PCRSSCP技術(shù)的引入，使得從大量標本中準確、靈敏地篩選出pol基因突變成為可能，對pol基因突變的研究更為深入8。本課題通過對40例鼻咽癌（均為鱗癌）pol基因的研究發(fā)現(xiàn)13例SSCP異常，突變率為32.5%，其突變點與報道的其他類型腫瘤中pol的突變有

13、所不同；核苷酸排列順序的改變，導致氨基酸的改變，可能致使錯配修復系統(tǒng)損傷，致原癌基因和腫瘤抑制基因突變, 最終導致腫瘤的發(fā)生；本研究還發(fā)現(xiàn), pol基因突變率隨鼻咽癌的惡性程度而增加。盡管DNA聚合酶基因與原癌基因與腫瘤抑制基因的關(guān)系還不十分清楚，但我們的研究表明鼻咽癌中存在pol基因突變現(xiàn)象，可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 【參考文獻】  1 Dobashi Y, Shuin T, Tsuruga H, et al. DNA polymerase mutation in human prostate cancerJ .Cancer Res, 1994，54(11):28272829.

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