廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《天然?；撬崤c人工合成?；撬岬蔫b別穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法》編制說明

1、.廣西壯族自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)鑒別天然牛磺酸和合成?；撬岬臋z測(cè)方法 穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法（征求意見稿）編制說明一、任務(wù)來源廣西壯族自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳，廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目，桂科攻0537009-1。廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2007年第二批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃，桂質(zhì)監(jiān)2007210號(hào)文（2007年3月）。二、項(xiàng)目背景與制定本標(biāo)準(zhǔn)的目的 ?；撬幔═aurine）又名牛膽酸、牛膽素、其化學(xué)名為2-氨基乙磺酸（H2N-CH2-CH2-SO3H），是一種含硫的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)氨基酸。研究表明牛磺酸具有廣泛的生物學(xué)功能，不僅參與維持體內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而且在中樞神經(jīng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管、免疫和內(nèi)分泌等

2、系統(tǒng)對(duì)生理功能正常發(fā)揮具有重要的調(diào)節(jié)作用。由于人體只能有限地合成?；撬幔虼?，膳食中的?；撬峋惋@得非常重要。珍珠貝肉中含有豐富的?；撬?，廣西是南珠的主要產(chǎn)地，每年采珠后珍珠貝肉作為下腳料丟棄，對(duì)廣西沿海灘涂環(huán)境造成污染。北海源龍珍珠有限責(zé)任公司發(fā)明了酶法從海水珍珠貝肉中提取天然?；撬岬墓に嚰夹g(shù)并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，既保護(hù)了環(huán)境又突破了天然牛磺酸產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)難題，為藥品、保健食品市場(chǎng)提供純天然牛磺酸產(chǎn)品。由于天然?；撬醽碓从谧匀簧矬w，對(duì)人體健康幾乎是無害的，而合成?；撬嵊捎谄浠瘜W(xué)中間產(chǎn)物潛在危害著人體健康，天然?；撬崾袌?chǎng)價(jià)格高出合成?；撬峒s100倍，一些不法商販以合成牛磺酸冒充天然?；撬幔\取暴

3、利，目前技術(shù)中尚未有鑒別天然?；撬岷秃铣膳；撬岬姆椒ê唾|(zhì)量體系，因此天然牛磺酸市場(chǎng)遭受嚴(yán)重干擾和不正當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)。本項(xiàng)目為了支持廣西優(yōu)勢(shì)資源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，保護(hù)海洋環(huán)境，監(jiān)管銷售市場(chǎng)，研究一種能夠鑒別天然?；撬岷秃铣膳；撬岬臋z測(cè)方法，開展鑒別天然?；撬崤c合成牛磺酸分析測(cè)試方法和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究，建立鑒別技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，制定廣西地方標(biāo)準(zhǔn)，具有重大的實(shí)際意義和學(xué)術(shù)價(jià)值。三 、制定本標(biāo)準(zhǔn)的工作簡(jiǎn)況項(xiàng)目承擔(dān)單位：廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心、北海市源龍生物科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心、北海市源龍生物科技有限公司。標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：莫建光、盧安根、陳秋虹、黃艷、石子聰、黃島平、徐慧、勞燕文。主

4、要工作過程：1.本標(biāo)準(zhǔn)編寫依據(jù)認(rèn)真學(xué)習(xí)中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)法、標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則、標(biāo)準(zhǔn)制定和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)定等相關(guān)文件資料，研究確定標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則和項(xiàng)目的實(shí)施方案。參照有關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)本產(chǎn)品的特點(diǎn)而制定標(biāo)準(zhǔn)。力求標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，各項(xiàng)指標(biāo)的試驗(yàn)方法引用國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法，引用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并參照?qǐng)?zhí)行。2.高純度天然牛磺酸試樣的制備采集了北部灣海域珍珠貝肉、東海貝肉、黃海貝肉和渤海貝肉，按如下技術(shù)路線提取高純度天然?；撬釂误w。貝肉 勻漿 調(diào)pH值 酶解 超聲浸提 浸提液滅酶 過濾 沉淀蛋白質(zhì) 離心分離 脫色 樹脂吸附純化 洗脫 真空濃縮 析出結(jié)晶 離心分

5、離 二次 純化 析出結(jié)晶 離心分離 干燥處理 高純度?；撬釂误w 制備獲得牛磺酸晶體2#（珍珠貝牛磺酸，北部灣-北海）、3#（珍珠貝?；撬幔辈繛?北海）、16#（牡蠣?；撬幔瑬|海-廈門）、17#（貝肉牛磺酸，黃海-青島）、18#（貝肉牛磺酸，黃海-青島）、19#（藍(lán)貝?；撬?，渤海-大連）、20#（文蛤?；撬?，東海-廈門）、3. 合成牛磺酸試樣的選擇 （1）合成?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：T0625-10G），含量：99.8%，美國(guó)Sigma公司，編記號(hào)為1#(1)；（2）合成牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品（BR，批號(hào)：70808），含量：99%，上海生物化學(xué)試劑公司，編記號(hào)為1#(2)；（3）合成牛磺酸純品(批號(hào):08

6、09226)，含量：99%，湖北黃岡市富馳公司, 編記號(hào)為1#(3)；（4）合成牛磺酸純品(批號(hào):0809227)，含量：99%，湖北黃岡市富馳公司, 編記號(hào)為1#(4)。4.試樣結(jié)構(gòu)確證及純度分析 4.1 紅外光譜分析 分別取1#(1)、1#(2)、1#(3)、1#(4)、2#、3#、16#、17#、18#、19#、20#試樣適量，溴化鉀壓片，按中華人民共和國(guó)藥典（2010年版二部）附錄IVC 紅外分光光度法測(cè)定試樣的紅外光吸收?qǐng)D譜，試樣的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)紅外光吸收?qǐng)D譜（光譜集44圖）對(duì)照一致。4.2 純度分析分別取1#(1)、1#(2)、1#(3)、1#(4)、2#、3#、16

7、#、17#、18#、19#、20#試樣適量制成上機(jī)液，用氨基酸分析儀檢測(cè)牛磺酸含量，其含量分別為99.8%、99.2%、99.3%、99.5%、98.5%、99.1%、82.9%、91.5%、89.5%、79.8%、90.2% 。5. 檢測(cè)方法研究對(duì)鑒別天然?；撬崤c合成牛磺酸的檢測(cè)方法同位素質(zhì)譜法進(jìn)行系統(tǒng)研究，其中包括檢測(cè)條件研究、方法學(xué)研究、天然牛磺酸C同位素、N同位素、S同位素比值與合成?；撬酑同位素、N同位素、S同位素比值的聚類分析研究、天然?；撬嵬凰乇戎蹬c合成?；撬嵬凰乇戎到Y(jié)果判定閾值的設(shè)定，摻偽試驗(yàn)研究、實(shí)驗(yàn)室之間的方法驗(yàn)證等。5.1 同位素質(zhì)譜法分析條件同位素質(zhì)譜儀的預(yù)調(diào)確認(rèn)同

8、位素質(zhì)譜儀工作環(huán)境、氣密性、離子室的真空度均符合要求，然后檢驗(yàn)同位素質(zhì)譜儀的穩(wěn)定性和峰型，必要時(shí)調(diào)整離子源參數(shù)值。確認(rèn)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)設(shè)置正確，必要時(shí)進(jìn)行調(diào)整。分析參數(shù)設(shè)定EA參數(shù)：氧化爐：10001060，還原爐：630680，柱溫：3595，載氣（氦氣）壓力：100kPa 。質(zhì)譜參數(shù)：質(zhì)普分析室真空（連續(xù)流模式）：1.52.0´10-6mbar。C分析：加速電壓：3528.37 V；萃取電壓：67%AV（加速電壓的百分比）；H板電壓：18.7462 V；Z板電壓：20.04 V；阱電流：200 uA；電子能量：100 eV；推板電壓：-8 V ；磁體電流：4000 mA。N分析：加速

9、電壓：4546.66 V；萃取電壓：75%AV（加速電壓的百分比）；H板電壓：33.9267 V；Z板電壓：21.9959 V；阱電流：200 uA；電子能量：100 eV；推板電壓：-7 V ；磁體電流：3500mA。S分析：加速電壓：2762.94 V(伏特)；萃取電壓：65%AV（加速電壓的百分比）；H板電壓：8.82 V；Z板電壓：-46.5436 V；阱電流：200 uA（微安 ）；電子能量：73.5 eV（電子伏特）；推板電壓：-8 V；磁體電流：4500 mA（毫安） 5.2 精密度試驗(yàn)分別取1#（1）和2#試樣0.11.0mg，按上述5.1分析條件，測(cè)定13C、15N、34S比

10、值，連續(xù)測(cè)定5次，試樣的13C、15N、34S值由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算給出，計(jì)算結(jié)果，得出合成?；撬?#（1）的RSD%值：13C的 RSD%為 0.30 ，15N的 RSD%為 4.39 ，34S的RSD%為1.35 ，18O的 RSD%為25.84 ，2H的 RSD%為44.76。天然?；撬?#的RSD%值：13C的 RSD%為 0.14 ，15N的 RSD%為 1.28 ，34S的RSD%為2.29 ，18O的 RSD%為19.61 ，2H的 RSD%為20.84。表明該方法的13C、15N、34S精密度良好（見表1，表2）。 表1合成?；撬?#（1）12345RSD%13C-27.54-27

11、.64-27.76-27.59-27.600.3015N-1.08-1.10-1.11-1.19-1.184.3934S9.7610.069.849.759.96 1.3518O-1.94-4.00-3.50-4.10-3.2425.842H6.5240.6336.4438.3538.0744.76表2天然?；撬?#12345RSD%13C-21.63-21.65-21.64-21.66-21.580.1415N10.6510.5410.2910.5610.471.2834S21.6021.9420.8420.9920.912.2918O9.026.066.295.716.5519.612H-

12、15.97-23.63-23.71-28.54-27.7320.825.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一來源同一批號(hào)的合成?；撬?份，同一來源同一批號(hào)的天然?；撬?份，分別按上述5.1分析條件，測(cè)定13C、15N、34S比值，計(jì)算平均值，RSD%值：合成牛磺酸1#（1）：13C的 RSD%為 0.16 ，15N的 RSD%為 3.84 ，34S的RSD%為1.43 ，18O的 RSD%為27.00 ，2H的 RSD%為45.31 。天然?；撬?#的RSD%值：13C的 RSD%為 0.30 ，15N的 RSD%為 2.30 ，34S的RSD%為1.00 ，18O的 RSD%為17.53 ，2H的 RSD%為

13、20.08。表明樣品處理過程和測(cè)定方法13C、15N、34S均有良好的重現(xiàn)性。表3 合成?；撬?#（1） 1 2 3 4 5平均值RSD%13C-27.66-27.68-27.63-27.59-27.58-27.630.1615N-1.14-1.19-1.20-1.17-1.22-1.143.8434S10.159.899.799.829.919.911.4318O-1.72-3.82-3.60-3.75-3.68-3.3127.002H6.3037.7936.9534.4941.1831.3445.31表4天然牛磺酸2# 1 2 3 4 5平均值RSD%13C-21.67-21.60-21.

14、63-21.77-21.69-21.670.3015N10.2510.7510.2110.6610.4510.462.3034S21.4120.9420.9020.9720.9721.041.0018O8.886.076.266.056.836.8217.532H-15.41-24.85-24.50-26.98-26.72-23.6920.08 5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)分別在0M、6M、12M、18M、24M、30M測(cè)定合成牛磺酸1#（1）和天然?；撬?# 試樣的13C、15N、34S比值，合成?；撬?#（1）RSD%分別為0.21、2.69、0.93、25.97、46.06。天然?；撬?#RSD%分

15、別為0.35、2.34、1.36、18.54、19.82。表明試樣在室溫下13C、15N、34S比值比較穩(wěn)定（見表5、表6）。表5合成?；撬?#（1） 0 1 2 3 4RSD%13C-27.53-27.58-27.50-27.59-27.650.2115N-1.76-1.72-1.84-1.82-1.802.6934S9.959.769.899.799.960.9318O-1.83-3.91-3.55-3.92-3.4625.972H5.7439.2136.6936.4640.2546.06表6天然?；撬?# 0 1 2 3 4RSD%13C-21.52-21.54-21.60-21.63-

16、21.710.3515N9.8410.0210.2110.2910.452.3434S21.5121.4120.9020.9420.991.3618O8.956.066.275.886.6918.542H-15.69-24.24-24.10-27.55-26.6019.825.6 樣品測(cè)定采集了渤海、黃海、東海、北部灣防城海域、北部灣欽州海域、北部灣北海海域的貝類天然?；撬針悠?6批，采購了美國(guó)Sigma公司、上海生物化學(xué)試劑公司、湖北黃岡市富馳化工有限公司、 江永安藥業(yè)股份有限公司的合成?；撬?批次，分別測(cè)定其13C、15N、34S、18O、2H比值，結(jié)果見表7。表7 天然?；撬峒昂铣膳；撬?/p>

17、S、N、C、O、H同位素比值檢測(cè)結(jié)果序號(hào) 檢測(cè)項(xiàng)目樣品名稱34S（)15N（)13C（)18O（)D（)備 注1#（1）合成?；撬幔ê?9.8%）19.95-1.08-27.54-1.835.74產(chǎn)地：美國(guó)Sigma批號(hào)：T0625-10G29.97-1.04-27.66-3.9139.211#（2）合成?；撬幔ê?9%）39.81-1.18-27.65-3.5536.69BR，批號(hào)：70808上海生物化學(xué)試劑公司49.79-0.99-27.59-3.9236.461#(3)合成牛磺酸（含量99.8%）59.94-1.75-27.59-3.4640.25產(chǎn)地：美國(guó)Sigma批號(hào)：T0827

18、-10G69.88-2.80-27.010.646.82#天然?；撬幔ê?8.5%）121.519.89-21.558.95-15.69北海（北部灣）220.9410.65-21.636.06-24.24320.8810.25-21.676.27-24.10420.9810.61-21.715.88-27.55520.9410.46-21.636.69-26.60620.679.30-21.022.5-13.73#天然?；撬幔ê?9.1%）120.386.55-20.659.05-45.13北海（北部灣）220.396.83-20.539.12-43.066#天然?；撬幔ê?3.5%）1

19、19.937.40-20.358.09-38.07北海（北部灣）219.927.34-20.588.22-37.667#天然牛磺酸（含量50.2%）120.178.60-19.347.36-33.21北海（北部灣）220.088.36-19.407.59-34.048#天然牛磺酸（含量78.9%）121.0913.49-19.199.86-26.46北海（北部灣）221.1013.45-19.289.96-26.429#合成?；撬幔ê?9.8%）110.140.19-20.074.4027.20產(chǎn)地：新西蘭210.010.31-20.194.2128.4910#天然牛磺酸（含量99.8%）1

20、20.526.82-20.597.05-41.05北海（北部灣）220.606.89-20.566.76-40.6411# 9:1（天:合）118.949.27-22.367.2210.14219.099.38-22.257.0612.0212# 8:2（天:合）116.898.28-22.957.2012.74216.878.33-23.056.8113.1713# 7:3（天:合）115.357.40-23.515.8519.60215.357.25-23.455.6320.9514# 6:4（天:合）113.956.54-23.895.0719.13213.966.61-23.864.5

21、121.19序號(hào) 檢測(cè)項(xiàng)目樣品名稱34S（)15N（)13C（)18O（)D（)備 注15#5:5（天:合）111.895.41-24.563.3322.16211.885.43-24.553.5123.9216#廈門牡蠣?；撬幔?2.9%）120.056.02-21.957.53-93.25廈門(東海)219.985.99-22.017.30-95.3817#青島蛤蜊?；撬幔?1.5%）120.4912.91-22.139.25-63.21青島(黃海)220.5312.90-22.099.03-64.0818#青島牡蠣牛磺酸（89.5%）120.5513.11-22.009.01-67.57

22、青島(黃海)220.5313.13-22.038.41-69.6719#大連藍(lán)貝牛磺酸79.8%120.538.56-19.9510.07-38.50大連(渤海)220.508.47-19.9110.12-38.7720#廈門文蛤?；撬?0.2%121.355.61-21.358.57-65.10廈門(東海)221.305.94-21.418.12-66.7421#合成?；撬?黃岡富馳，批號(hào):0809226)99.813.440.79-27.28-1.57-22.54湖北黃岡市富馳23.430.70-27.30-1.62-20.7522#天津蛤蜊?；撬?0.4%120.638.77-19.87

23、8.09-38.07天津(渤海)220.598.68-20.038.13-38.2623#廣西欽州珍珠貝?；撬?8.5%121.039.32-19.556.69-26.60欽州（北部灣）221.239.23-19.666.88-26.9024#廣西欽州珍珠貝?；撬?9.3%120.7910.09-21.369.09-40.09欽州（北部灣）220.849.88-21.459.32-39.0725#廣西防城珍珠貝?；撬?3.3%119.978.09-19.818.16-37.87防城（北部灣）219.999.25-19.798.30-37.9426#廣西防城珍珠貝?；撬?9.2%120.967.

24、90-20.659.91-26.44防城（北部灣）220.687.89-20.6110.21-27.0327#合成牛磺酸（潛江永安，批號(hào)：）97.2%13.430.74-27.29-1.60-21.65潛江永安藥業(yè)股份有限公司23.510.82-27.32-1.78-21.96表7 天然牛磺酸及合成?；撬酳、N、C、O、H同位素比值檢測(cè)結(jié)果5.7.聚類分析附注創(chuàng)建的輸出23-六月-2012 22時(shí)20分32秒注釋 輸入活動(dòng)的數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)集0過濾器<none>權(quán)重<none>拆分文件<none>工作數(shù)據(jù)文件中的 N 行46缺失值處理對(duì)缺失的定義用戶定義的缺失值作

25、為缺失數(shù)據(jù)對(duì)待。使用的案例統(tǒng)計(jì)是在所使用的變量不帶有缺失值的案例基礎(chǔ)上進(jìn)行的。語法CLUSTER 34S 15N 13C /METHOD MEDIAN /MEASURE=SEUCLID /ID=VAR00001 /PRINT SCHEDULE /PLOT DENDROGRAM.資源處理器時(shí)間00:00:00.327已用時(shí)間00:00:00.343數(shù)據(jù)集0 案例處理匯總a,b案例有效缺失總計(jì)N百分比N百分比N百分比46100.00.046100.0a. 平方 Euclidean 距離 已使用 b. 中值聯(lián)結(jié)中值聯(lián)結(jié)聚類表階群集組合系數(shù)首次出現(xiàn)階群集下一階群集 1群集 2群集 1群集 213445

26、.00200422728.002001932526.003001943334.00501952324.00900376810.010001271920.010004282930.011001793346.0114044102122.01200131112.016001412811.0316024131421.032010251414.034110151513.03114029163536.0350017172935.05481630183940.0550027192527.0563242201516.0570032213738.0600036221718.0690028234344.08000

27、352489.09212027251314.10401332263132.115003727839.245241831281741.370220302915.43015038301729.5002817333178.50702734321315.725252035331742.73630036347121.109310393513431.1673223403617371.1753321393723312.1295264138162.25529044397172.947343640407133.712393541417237.6984037434219258.529719434371937.30

28、34142454413349.542389454517356.73744430 從樹狀圖檢測(cè)號(hào)1、2、3、4、5、6、33、34、45、46、57、58的樣品是一類。檢測(cè)號(hào)7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56的樣品是另一類。5.8.天然?；撬嵬凰乇戎蹬c合成?；撬嵬凰乇戎到Y(jié)果判定范圍 通過對(duì)16批不同海域貝類?；撬岷?批不同廠商生產(chǎn)的合成?；撬幔?8份樣品測(cè)定其

29、C、N、S、O、H同位素比值（），采用Dendrogran Using Average Linkage（Betveen Groups）聚類方法，從樹形圖上分析得出兩類?；撬?，即1#（1）、1#（2）、1#（3）、21#、27#是一類，稱為A類；2#、3#、6#、7#、8#、9#、10#、16#、17#、18#、19#、20#、22#、23#、24#、25#、26#是另一類，稱為B類。從表7中可知A類為合成?；撬?，B類為天然?；撬?，它們的C、N、S同位素比值范圍為：A.合成?；撬岬耐凰乇戎捣秶?13C（PDB）為-26.00-28.0015N（Air-N2）為-1.00-3.00 34S（CD

30、T）為8.0011.00B.天然?；撬岬耐凰乇戎捣秶?13C（PDB）為-19.00-22.00 15N（Air-N2）為6.0014.00 34S（CDT）為19.0022.00 5.9. 驗(yàn)證經(jīng)過核工業(yè)北京地質(zhì)研究院分析測(cè)試研究中心、中科院環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證結(jié)果基本一致，表明方法可行，數(shù)據(jù)可靠。表9 方法學(xué)考察和樣品檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果驗(yàn)證項(xiàng)目廣西分析測(cè)試研究中心中科院環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室核工業(yè)北京地質(zhì)研究院分析測(cè)試研究中心同位素比值測(cè)定1#（1）13C -27.5415N -1.7534S 9.9513C -27.6615N -1.0434S 9.9713C -27.0 15

31、N -2.8 34S -2#13C -21.5515N 9.8934S 21.5113C -21.6315N 10.6534S 20.9413C -21.0 15N 9.30 34S -5.10. 摻偽試驗(yàn)研究取天然牛磺酸2#樣品、含量為98.5%，合成?；撬?#（1）樣品、含量為99.8% 。分別精密稱取樣品2#和1#（1）各8份，配成天然?；撬崤c合成?；撬峄旌蠘樱旌媳壤秊樘烊慌；撬幔汉铣膳；撬?:1，8.5:1.5，8:2、7.5:2.5，7:3，6.5:3.5，6:4，5.5:4.5，5:5，并編號(hào)為11#、12#、13#、14#、15#，將混合的樣品分別于水中完全溶解后，真空濃縮干燥測(cè)定其13C、15N 、34S比值。結(jié)果見表10。表10樣品號(hào)2# :1#（1）13C15N34S11#9:1-22.319.3219.01 12#8:2-23.008.3016.8913#