免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白

1、免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦妹庖弑葷岱ɡL制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)樣品中免疫球蛋白的濃度。（本小組檢測(cè)的為IgG樣品）二、實(shí)驗(yàn)原理1.抗原抗體反應(yīng)(Antigen-antibody reaction)：抗原與其刺激機(jī)體產(chǎn)生的相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的反應(yīng)。反應(yīng)特點(diǎn)有：特異性、比例性、可逆性、敏感性。影響因素有：電解質(zhì)、溫度、酸堿度。2.免疫比濁法：合適比例的抗原抗體形成的免疫復(fù)合物，在PEG作用下形成微粒，使樣品濁度發(fā)生變化。當(dāng)一束光線通過(guò)溶液受到光散射和光吸收兩個(gè)因素的影響而使光的強(qiáng)度減弱，根據(jù)光的強(qiáng)度改變可測(cè)得微粒濃度。分類：透射比濁法（Transmission tubidi

2、metry）當(dāng)一定波長(zhǎng)光線通過(guò)濁度發(fā)生變化的反應(yīng)混合物時(shí)，由于被不溶性免疫復(fù)合物吸收而減弱，故在一定范圍內(nèi)吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)。當(dāng)抗體濃度固定（過(guò)量），樣品的濁度與其中所含抗原量成正比。（特點(diǎn)）透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)。散射比濁法（Nephelometry）光線通過(guò)檢測(cè)溶液時(shí)，被其中所含的抗原抗體復(fù)合物折射而部分偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光，其強(qiáng)度與復(fù)合物的數(shù)量和散射夾角成正比，與光的波長(zhǎng)成反比。（特點(diǎn)）優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，

3、試劑價(jià)格高。本實(shí)驗(yàn)采用透射法。3.聚乙二醇PEG的作用：在免疫反應(yīng)中，為增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)常使用增聚劑，34的聚乙二醇，可破壞抗原抗體的水化層，促進(jìn)抗原抗體靠近反應(yīng)，但如濃度不適合，會(huì)影響其它溶質(zhì)或產(chǎn)生非特異性聚集影響結(jié)果。三、實(shí)驗(yàn)材料免疫球蛋白A,G(IgA,IgG)測(cè)定試劑(試劑1PEG，試劑2羊抗人IgA, IgG）（1管/每組）免疫球蛋白A, G(IgA,IgG)校準(zhǔn)品，蒸餾水，血清樣本（1管）微量加樣槍、ep管（1.5mL離心管）酶標(biāo)儀、水浴箱四、實(shí)驗(yàn)步驟1.在7個(gè)EP管中各加250L IgG試劑1（PEG）。2.7管分別加入蒸餾水、校準(zhǔn)品原液、1：2校準(zhǔn)品、1：4校準(zhǔn)品、1：8校準(zhǔn)品

4、、1：16校準(zhǔn)品、樣本各2L。3.混勻后37水浴5min。4.7管各加入85L IgG試劑2（羊抗人IgG）。5.混勻后37水浴10min。6.分別吸取200L至96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀在700nm處讀取OD值。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)處理1.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管內(nèi)容空白對(duì)照原液34.8g/L1：21：41：81：16樣本OD值0.0780.6910.5700.2610.1940.1480.6042.標(biāo)準(zhǔn)曲線3.樣本濃度：y=0.604代入x=26.648g/L由此得稀釋之前樣本的濃度為79.945g/L誤差：（79.945-34.8）/34.8*100=129.73%誤差分析：抗原抗體反應(yīng)需要一定孵育時(shí)間和

5、溫度，而操作中由于加樣的速度限制，無(wú)法嚴(yán)格控制各管的反應(yīng)時(shí)間；本次制作標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)量極小，很有可能出現(xiàn)未混勻、掛壁的情況；標(biāo)準(zhǔn)液吸取量小會(huì)導(dǎo)致移液槍的誤差被放大。免疫比濁法的基本原理是基于抗原抗體結(jié)合，而這個(gè)結(jié)合反應(yīng)有特殊性，只有在一定范圍濃度中，兩者比例合適時(shí)檢測(cè)結(jié)果才準(zhǔn)確，否則會(huì)產(chǎn)生帶現(xiàn)象，已有文章表明，稀釋前后檢測(cè)結(jié)果偏差很大(朱愛萍, 郭書云, 趙銳. 免疫比濁法檢測(cè)異常血清免疫球蛋白的方法學(xué)探討J. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 1999(4):33-34.)，所以我認(rèn)為此樣本雖然是由原液稀釋三倍所得，但在溶液中IgG抗體的濃度都相同的情況下，兩管中抗原抗體比例相差很大，所以檢測(cè)結(jié)果也有偏差是可以

6、理解的。同時(shí)再結(jié)合散點(diǎn)圖擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以發(fā)現(xiàn)，濃度較高的兩管標(biāo)準(zhǔn)液距離擬合曲線的偏差是最大的，由此推斷，1：1原液和1：2原液并不適合本次實(shí)驗(yàn)中所給的羊抗人抗體濃度（未知）。所以，誤差來(lái)源除了以上所說(shuō)原因之外，還有本次實(shí)驗(yàn)提供的抗體濃度，并不適合原液中IgG濃度的檢測(cè)，而稀釋三倍后的樣品屬比較適合的范圍。所以最大的誤差來(lái)源是抗體濃度的選擇，雖然抗體濃度是保證過(guò)量的，但是過(guò)量的程度相對(duì)每個(gè)管來(lái)說(shuō)是不同的，1：1和1：2也許需要更大的濃度。六、思考1.本實(shí)驗(yàn)采用的免疫比濁法適用于人體內(nèi)哪幾種Ig？人體血清中含有五類免疫球蛋白，分別為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中前三種含量相對(duì)較

7、高，而IgD和IgE含量極低，膜結(jié)合型IgD構(gòu)成BCR，是Bcell成熟的標(biāo)志，IgE在正常人血清中含量最少，與型超敏反應(yīng)和寄生蟲感染有關(guān)。理論上此五種Ig均可以采用免疫比濁法檢測(cè)含量，但臨床上常只檢測(cè)前三種含量較高、疾病相關(guān)性更強(qiáng)的Ig，在考慮寄生蟲感染和變態(tài)反應(yīng)性疾病時(shí)還可以檢測(cè)血清中IgE的含量。2.檢測(cè)血清等體液標(biāo)本中某種抗原分子的方法？原理同本實(shí)驗(yàn)，采用抗原抗體結(jié)合的原理，凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)，以及免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，在使用抗原抗體結(jié)合原理時(shí)，將抗體加入熒光可以直接檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)定量檢測(cè)抗原含量，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)還可采用雙抗體法以級(jí)聯(lián)放大更易檢測(cè)。3.使用免疫比濁法時(shí)，抗原抗體的比例應(yīng)采用哪個(gè)區(qū)域？應(yīng)采用抗體過(guò)量的前帶，因?yàn)樗鶛z測(cè)的物質(zhì)是抗原，希望所加樣品中的抗原完全與抗體結(jié)合形成微粒，所有的微粒均可吸收酶標(biāo)儀中透過(guò)的光線。因?yàn)槲舛萇D值與溶液中顆粒的濃度成正比，而計(jì)算時(shí)默認(rèn)顆粒的濃度與樣品中所含抗原的濃度相當(dāng)，所以，只有在抗體含量過(guò)量時(shí)，才能保證所有抗原都能與抗體結(jié)合形成微粒，降低因抗原未完全結(jié)合抗體所帶來(lái)的誤差。而且結(jié)合本次誤差，不同管抗體過(guò)量的