新型亞甲基四氫葉酸還原酶單核苷酸多態(tài)性研究方法檢測惡性血液病易感性

1、新型亞甲基四氫葉酸還原酶單核苷酸多態(tài)性研究方法檢測惡性血液病易感性 作者：陳寶安姜妮祭美菊侯鵬 陸祖宏高沖 丁家華,孫耘玉王駿程堅(jiān)趙剛【摘要】 本研究探討一種新型亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測方法，并用其檢測惡性血液病遺傳易感性。根據(jù)cDNA芯片原理制作一種目的基因芯片，利用雙色熒光探針雜交進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測，測序法對該芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證,并以此對來自中國江蘇地區(qū)的157例健康對照和127例惡性血液病患者(30例多發(fā)性骨髓瘤，28例非霍奇金淋巴瘤，22例急性淋巴細(xì)胞白血病，40例急性髓系白血病，7例慢性髓系白血病)的MTHFR基因C677T多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行

2、檢測。結(jié)果表明，為野生型、雜合型和突變型的疊加熒光分別顯示為綠色、黃色和紅色。測序結(jié)果與芯片結(jié)果吻合。677C和677T在病例和對照組的基因頻率分別為58.7%、66.9%、41.3%和33.1%，差異有顯著性（2=4.077, P=0.043）。677TT基因型發(fā)生MM相對風(fēng)險明顯增加（OR=4.21；95%CI=1.50-11.83；P=0.006）。結(jié)論：本芯片檢測方法準(zhǔn)確、高通量且價格低廉，適用于大規(guī)模樣本SNP調(diào)查；C677T多態(tài)改變影響惡性血液病的發(fā)病風(fēng)險。677TT基因型是MM的易感因素。 【關(guān)鍵詞】 單核苷酸多態(tài)性； 基因芯片； 雙色熒光雜交； 亞甲基四氫葉酸還原酶； 惡性血液

3、病A New Method for 5,10-Methylenetetrahydrofolate Reductase Single Nucleotide Polymorphisms Genotyping Used to Study Susceptibility of Hematological MalignancyAbstractThe aim of this study was to set up a new method for 5,10- Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) single nucleotide polymorphisms

4、 (SNP) genotyping, and to investigate the hereditary susceptibility of hematological malignancy. Prepared an aimed gene microarray based on cDNA microarray theory, dual- color fluorescenece hybri- dization was used to detect SNP loci, and DNA sequencing was performed to confirm the results. The MTHF

5、R C677T SNP loci of 157 controls and 127 patients with hematological malignancies (30 multiple myeloma, 28 non- Hodgkins lymphoma, 22 acute lymphoblastic leukemia, 40 acute myeloid leukemia, 7 chronic myeloid leukemia) from Jiangsu province were detected. The results showed that after overlapping, h

6、omozygous wild type, heterozygote type and homozygous mutant type yielded green, yellow and red fluorescence, respectively. DNA sequencing validated these results. The allele frequency of 677C and 677T in patients and controls were 58.7% and 66.9%, 41.3% and 33.1% respectively, showing statistically

7、 significant difference (2=4.077, P=0.043). 677TT genotype showed a significantly higher risk of MM (OR=4.21; 95%CI=1.50-11.83; P=0.006). It is concluded that this microarray- based method is accurate, high- throughput and inexpensive, suitable for SNP genotyping in a large numbeer of individuals. C

8、677T polymorphisms influence the risk of hematological malignancies. 677TT genotype is susceptive to MM.Key words single nucleotide polymorphism; gene microarray; dual- color fluorescenece hybridization; 5,10- methylenetetrahydrofolate reductase; hematological malignancy染色體DNA序列的某個位點(diǎn)上存在的單個堿基變化如果在人群中

9、的發(fā)生頻率超過1%，即為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。表達(dá)基因平均每1 000 bp即出現(xiàn)一個SNP位點(diǎn)，是人類基因組序列變異的主要形式。在不同的人群中，SNP的頻率分布有差異，這些差異可以代表某一種族或人群間的遺傳差異。研究SNP有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復(fù)雜疾病的易感性，以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應(yīng)性。因此，有必要建立一種準(zhǔn)確、費(fèi)用低、適合大樣本的SNP檢測方法。近年來研究表明，葉酸缺乏和（或）葉酸代謝異?？蓪?dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝

10、的關(guān)鍵酶，其基因C677T位點(diǎn)多態(tài)改變引起酶活性下降，已被證實(shí)它與多種腫瘤的易感性有關(guān)。為此我們建立一種芯片檢測方法，并對惡性血液病患者的C677T位點(diǎn)進(jìn)行初步分析。材料和方法研究對象127例病例樣本取自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院和南京鼓樓醫(yī)院2004年1月至2004年11月收治的血液腫瘤患者。在127例病例中多發(fā)性骨髓瘤（MM）30例，非霍奇金淋巴瘤（NHL）28例，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）22例，急性髓系白血?。ˋML）40例，慢性髓系白血?。–ML）7例。所有MM經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、血或尿M蛋白、本- 周氏蛋白檢測及扁骨X光片確診，NHL經(jīng)組織病理確診，白血病患者經(jīng)骨髓細(xì)胞形

11、態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)確診，所有患者排除已行異基因造血干細(xì)胞移植。157例健康對照樣本取自同期在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院健康查體人群，對照人群排除惡性腫瘤、冠心病。所有標(biāo)本均為EDTA抗凝的外周血。病例組男76人，女51人，年齡18-79歲，平均年齡47.39歲；對照組男98人，女59人，年齡22-75歲，平均年齡48.55歲。兩組性別、年齡分布無顯著差異（P值分別為0.657和0.533）。常規(guī)酚- 氯仿法提取基因組DNA。目的片段的PCR擴(kuò)增和純化采用已報(bào)道的引物序列1，C677T位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系為30 l，其中含10的緩沖液3 l，25 mmol/L的Mg2+溶液2 l

12、，10 mmol/L的dNTP 0.6 l，10 mol/L的雙側(cè)引物各1 l ，1.25 U的Taq DNA聚合酶（5 U/L），提取的基因組DNA 1 l。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性5分鐘，94變性30秒，62退火30秒，72延伸30秒，共35個循環(huán)，72延伸7分鐘。擴(kuò)增在Gene Amp 2400 PCR System上進(jìn)行。QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。分光光度計(jì)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量并將產(chǎn)物溶于3SSC緩沖液中，濃度為300 ng/l。目的片段芯片的制備及雜交將PCR產(chǎn)物通過PixSys 5500點(diǎn)樣儀（Cartesian Technology Inc產(chǎn)品）點(diǎn)于氨基玻

13、片上。點(diǎn)樣后玻片水化30分鐘，100快干2秒，400 mJ紫外交聯(lián)，80干烤2小時。野生型探針677CC：5- Cy3-CGGGAGCCGATTT- 3，突變型探針677TT：5- Cy3-CGGGAGTCGATTT- 3。將熒光標(biāo)記探針1 mol/L（野生型和突變型探針各半）與雜交液（Telechem）按體積13混合。在潮濕的雜交盒中37雜交2小時。室溫下分別用2SSC- 0.1% SDS 和 0.1SSC -0.1% SDS清洗5分鐘，滅菌雙蒸水清洗2分鐘后吹干玻片。用ScanArray Lite 微陣列分析系統(tǒng) （BioScience Company產(chǎn)品）進(jìn)行芯片掃描。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理病例組和

14、對照組的MTHFR基因型的頻率差異以2檢驗(yàn)確定，P0.05），在我們的對照組中677T基因頻率為33.1%，與上海地區(qū)人群的基因頻率相似6，明顯低于中國北方人群7以及上述意大利人群，這不足以解釋該結(jié)果。同時我們的數(shù)據(jù)顯示677TT的ALL發(fā)病風(fēng)險有下降趨勢（OR=0.38； 95%CI=0.39-4.8），與大多數(shù)的研究結(jié)論一致，但獲得能反映真實(shí)情況的結(jié)果可能還需要擴(kuò)大樣本含量。C677T與AML發(fā)病風(fēng)險無關(guān)，這與目前所有AML的研究結(jié)果一致。NHL發(fā)病風(fēng)險與C677T沒有明顯相關(guān)，這符合高加索人種間的研究結(jié)果8；但降低的酶活性似乎使患病趨勢增加，這與Skibola等9報(bào)道的677TT基因型的

15、個體發(fā)生濾泡淋巴瘤的相對風(fēng)險度升高存在一致性。相反，對日本人群的研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)677T發(fā)生NHL的風(fēng)險下降10。不盡相同的研究結(jié)果說明MTHFR C677T與疾病易感性關(guān)系可能因地區(qū)人群的基因頻率而異，因生活習(xí)慣而異，或者還受某些相關(guān)基因多態(tài)的影響（如MTHFR A1298C；蛋氨酸合酶 A2756G；亞甲基四氫葉酸脫氫酶 G1958A）。因此要取得反應(yīng)真實(shí)情況的研究結(jié)果可能需要更大的樣本含量，精確的疾病分型，合理的對照，多因素的分析。我們將在MTHFR SNP與惡性血液病遺傳易感性的后續(xù)研究中加以完善，而雙色熒光雜交微陣列方法將為我們的研究提供高通量平臺?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Frosst P,

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